首页 > 文献资料
-
金葡菌野生株SEB基因的亚克隆及其原核表达
目的 亚克隆金葡菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达,以获得重组SEB(Rseb)蛋白.方法 将含有SEB基因的质粒Pmd-18T/SEB双酶切获得目的片段,插入表达载体Pgex-4T-2中构建重组子Pgex-4T-2/SEB,并转化E.coli JM109感受态菌,阳性克隆以双酶切和PCR法鉴定;含重组质粒的工程菌以IPTG诱导表达Rseb蛋白;表达产物进行SDS-PAGE分析,并采用B-PER GST融合蛋白试剂盒纯化重组Rseb,Western blot鉴定其免疫反应性.结果 重组质粒经双酶切和PCR扩增鉴定均获得约705 bp的基因片段,与预期结果相一致;诱导表达的含GST的融合重组Rseb蛋白分子质量单位约为53 ku,纯化后作SDS-PAGE电泳显示一条蛋白带,Western blot显示Rseb能够被兔抗SEB抗体识别.结论 金葡菌野生株SEB在大肠埃希氏菌中得到有效表达,并获得电泳级纯度的重组Rseb,重组蛋白具有一定的免疫活性,为进一步研究其生物毒性与开发诊断试剂提供了生物材料.
-
慢性荨麻疹患者血清金黄色葡萄球菌超抗原特异性IgE检测及其意义
目的 检测慢性荨麻疹(CU)患者血清金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)超抗原肠毒素A(SEA)、肠毒素B(SEB)和中毒性休克综合征毒素(TssT-1)的特异性IgE(slgE),分析该超抗原sIgE与慢性荨麻疹相关性,探讨其发病机制.方法 采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测63例慢性荨麻疹患者和60例正常对照组血清金葡菌超抗原SEA、SEB和TssT-1的slgE水平,分别进行金葡菌超抗原(SEA、SEB、TssT-1和SEA/SEB/TssT-1)sIgE比较,并将其浓度与病情程度评分(UAS)进行相关性分析.结果 CU患者血清中金葡菌超抗原(SEB、TssT-1和SEA/SEB/TssT-1)slgE水平均高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);金葡菌超抗原(SEA、SEB和SEA/SEB/TssT1)sIgE水平分别与CU病情轻中重度和荨麻疹活动评分(Urticaria activity score,UAS)呈正相关(P＜0.05).结论 慢性荨麻疹患者血清中金葡菌肠毒素A、肠毒素B和TssT-1 sIgE水平升高,可能与其慢性病程及严重程度有关.
-
金葡菌野生株肠毒素B基因克隆及分子特征
目的克隆金黄色葡萄球菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并分析其分子特征.方法根据Genebank中金黄色葡萄球菌S6株肠毒素B基因设计1对引物,采用PCR法从金黄色葡萄球菌野生株S407030基因组中扩增目的基因,将目的片段与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB,并转化E.coli DH5 a;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法作序列测定分析,并以ExPasy Proteoic Tools蛋白分析软件预测其编码SEB蛋白的二级结构.结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约705bp的基因片段,所构建的阳性克隆重组子PCR及双酶切鉴定与预期结果一致;测序结果表明,克隆的SEB基因含705个碱基,与S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%;存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364,699,899,988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser、Met→Leu);所预测的2菌株SEB蛋白的二级结构基本相同.结论本实验成功克隆了金葡菌野生株S407030SEB基因,其在不同菌株间相对保守;由SEB基因点突变引起的个别氨基酸的改变对SEB生物活性与毒力的影响有待进一步研究.
-
金黄葡萄球菌野生株肠毒素B重组蛋白的表达及纯化
目的 在大肠埃希菌中表达金黄葡萄球菌野生株肠毒素B(SEB)重组蛋白,并进行纯化.方法 采用PCR方法 从金黄葡萄球菌基因组中扩增出SEB基因片段,与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMDi8-T/SEB,测序分析后,亚克隆入表达载体pGEX4T-2,转化感受态E coli JM109,IPTG诱导表达.表达产物采用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit纯化后进行Western blot鉴定.结果 SEB基凶扩增片段大小为705 bp,测序结果 显示与金黄葡萄球菌S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%,存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364、699、899和988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser和Met→Leu);表达的含GST的融合蛋白相对分子质量约53 000,纯化后经SDS-PAGE分析,可见单一条带.Western blot显示表达产物可被兔抗SEB抗体所识别.结论已成功表达并纯化了金黄葡萄球菌野生株SEB重组蛋白,为开发SEB免疫诊断试剂提供了材料.
-
金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal entertoxin B,SEB).方法 以合成的SEB全基因序列为模板,PCR扩增SEB基因片段,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-SEB,转化E.coil BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经硫酸铵盐析、SP阳离子层析柱、Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱纯化后,用Thrombin切除组氨酸标签,再经Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱和DEAE阴离子层析柱纯化.结果 重组原核表达质粒pET-28a-SEB经双酶切及测序证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为31000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30％.终纯化后的重组SEB蛋白纯度可达90％以上.结论 成功构建了SEB基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了重组SEB蛋白,为进一步研究其致病机理及防控方法奠定了基础.
-
金黄色葡萄球菌肠毒素B对脐静脉内皮细胞凋亡的影响
目的 观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)诱导脐静脉内皮细胞的凋亡效应.方法 用不同浓度SEB感染脐静脉内皮细胞(HUVEC)2、4、8与12h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 SEB各浓度均可诱导HUVEC发生凋亡,与对照组比较差异有高度统计学意义(P<0.01).当SEB浓度为5μg/ml时诱导细胞凋亡的能力强;5μg/ml SEB作用HUVEC细胞2h后,即可诱导细胞产生明显的凋亡,且随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐增加(P<0.01).结论 SEB可以诱导脐静脉内皮细胞凋亡,并表现出明显的时间、剂量效应关系,这可能与金葡菌L型垂直感染影响宫内胎儿发育的机制有关.
-
金黄色葡萄球菌肠毒素B对体外培养小鼠胚胎发育的影响
目的 了解金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对胚胎发育的影响.方法 采用植入后全胚胎培养技术,将8.5d小鼠胚胎与终浓度分别为0.1、1及10μg/ml的SEB共培养48h后,观察SEB对胚胎生长发育和器官形态分化影响.结果 SEB可影响体外小鼠胚胎的发育.0.1μg/ml SEB首先影响卵黄囊直径,当SEB为1及10μg/ml时,胚胎生长发育指标和器官形态分化评分均明显低于对照组,并出现小头、脑膨出、前后神经管未闭、体位异常、鳃弓及前肢发育迟缓、大心包及心包积液等畸形.结论 SEB能明显影响体外小鼠胚胎发育,可能是金葡菌L型导致体外胚胎发育畸形的主要机制之一.
-
金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆及原核表达
目的 构建金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因的原核表达克隆,并在大肠杆菌中表达.方法 从金黄色葡萄球菌中提出DNA,PCR扩增出肠毒素B(SEB)成熟肽前体蛋白基因,将其插入到质粒pGEX-4T-2编码谷胱甘肤转移酶(GST)的多克隆位点(MCS),构建原核表达克隆(PGEX-4T-2/SEB).重组质粒经酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达目的 蛋白.SDS-PAGE电泳分析蛋白图谱.Western blot鉴定表达蛋白.结果 经酶切和测序分析,表明成功构建了pGEX-4T-2/SEB原核表达克隆.经IVTG诱导,转化的大肠杆菌表达出相对分子质量(Mr)为55×103Daltons的融合蛋白,且该蛋白能与抗SEB抗体发生特异性结合反应.结论 金黄色葡萄球菌肠毒素B(SES)基因原核表达克隆的成功构建,并在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究肠毒素B(SEB)的生物学功能和-临床应用奠定了基础.
-
金黄色葡萄球菌SEB基因的克隆及其系统发生分析
目的 克隆和测定金黄色葡萄球菌深圳分离株S4070肠毒素B(SEB)基因序列,并作系统发生分析.方法 采用PCR法从金黄色葡萄球菌S4070基因组中扩增出SEB基因片段,纯化后与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB,并转化E.coli DH5α;阳性克隆质粒经双酶切法鉴定后,采用双脱氧末端终止法作序列测定,并以BLAST和MEGA4软件分析其分子特征.结果 从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约704bp的基因片段,阳性克隆质粒鉴定结果与预期一致；序列测定结果显示,所克隆的SEB基因片段含704个碱基,与GenBank中17株金黄色葡萄球菌SEB基因序列比对,无碱基的插入或缺失,同源性均为98％以上；基于SEB基因序列,采用邻位连接法(Neighbor-joining)构建系统发生树,深圳S4070株与日本分离株NN35、NN37、NN41-F1D、NN41-F1F和NN41-F1G以及印度分离株DQ535901、DQ535902的遗传距离小,同处在一个分支群上.结论 实验成功克隆了金葡菌深圳株S4070 SEB基因,不同分离株间SEB基因序列相对保守,本分离株与日本和印度分离株遗传关系较近.
-
金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达
目的：扩增金黄色葡萄球菌肠毒素 B（SEB）基因，构建其原核表达载体，并进行诱导、表达，为其应用研究奠定基础。方法根据 GenBank 中 SEB 的基因序列，设计一对分别含 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点的特异性引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA 为模板进行 PCR 扩增后，经 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切，并与做相应酶切的 pET‐28α（＋）连接，转化大肠杆菌 BL21，提取质粒进行双酶切鉴定及测序，用 IPTG 诱导表达融合蛋白，SDS‐PAGE 和 Western blot 印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出 SEB 基因，基因大小为801 bp ，重组 PET‐28α（＋）‐SEB 双酶切鉴定可见目的片段，测序结果显示 SEB 在正确读框中，序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99％。经 IPTG 诱导后，pET‐28α（＋）‐SEB／BL21在相应的相对分子质量（35×103）可见融合蛋白以包涵体形式表达，免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了 SEB 基因，并成功在大肠杆菌 BL21中以包涵体形式表达，为肠毒素 B 应用研究奠定了基础。
