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非疟疾流行区非典型疟疾患者临床误诊分析
海南岛为疟疾高发区,1年四季皆有疟疾发生.而海口市位于海南岛北部,因缺乏海南岛的传疟媒介大劣按蚊或只具有极低密度的传疟媒介微小按蚊,缺乏传播势态定为非疟疾流行区,疟疾病例发生较少.但随着城乡经济的发展,城乡人群的交往频繁,在海口市各医院近年常发生疟疾误诊.为分析误诊原因,总结经验,以引起临床医生的注意,提高诊治水平,现总结2004年海南省中医院发生的2例误诊病例,结果报告如下.
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球型芽孢杆菌2362株对两种按蚊幼虫杀伤效果的比较研究
目的 了解球形芽孢杆菌2362株(Bs)对大劣按蚊及斯氏按蚊幼虫的毒力作用,为生物杀虫剂的使用提供科学依据. 方法 利用Probit analysis方法在实验室对球型芽孢杆菌2362株杀伤大劣按蚊和斯氏按蚊幼虫的效果进行了生物测定,并对两种按蚊的敏感性进行了比较研究. 结果 球形芽孢杆菌2362株对大劣按蚊幼虫48 h和72h的LC50值为(0.0151±0.0029) mg/l和(0.0110±0.0014)mg/l,LC95值为(0.0960±0.0099)mg/l和(0.0529±0.0193)mg/l;对斯氏按蚊Hor株幼虫48h和72h的LC5o值为(0.0184±0.0015)mg/l和(0.0162±0.0014)mg/l,LC95值为(0.0850±0.0219)mg/1和(0.0620±0.0114)mg/l. 结论 球形芽孢杆菌2362株对大劣按蚊和斯氏按蚊均有较好的杀伤效果,大劣按蚊对Bs的敏感性似较斯氏按蚊幼虫略高,且作用持续时间也稍长.
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海南省昌江县王下乡大劣按蚊吸血活动观察
目的了解当地主要传疟媒介大劣按蚊叮人吸血规律,为今后制定抗疟措施提供依据.方法采用人饵通宵诱捕.结果大劣按蚊叮人吸血高峰在22:00-2:00.结论应加强个人防护及管理传染源等措施来阻断疟疾的传播.
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海南省寄生虫病防治现状、问题与建议
海南省地处我国南疆热带地区,年平均气温22～26℃,适宜寄生虫病的发生、传播和流行.建国初,疟疾、丝虫病及肠道寄生虫病高度流行,危害甚烈.经40余年的大力防治,疟疾已得到控制,1986年丝虫病在全省范围内达到基本消灭.但是,人群寄生虫总感染率仍高达94.7%[1],迄今已查见寄生虫50种,肠道寄生虫感染率居高不下,丝虫病监测任务繁重,恶性疟抗药性继续发展,山区疟疾难以防治,疟疾暴发流行的威胁依然存在,寄生虫病防治任务十分艰巨.1 疟疾1.1流行情况海南省是我国的高疟区,二十世纪50年代初年发病率达5000/10万～10000/10万,死亡率为10.4/10万.4种人体疟原虫均有发现,32种按蚊中6种为传疟媒介,其中微小按蚊和大劣按蚊的自然感染率分别为4.3%和3.5%.平原、丘陵和山区居民的原虫率分别为12%、34%和74%,恶性疟占60%.
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海南省大劣按蚊实验室自然交配的驯化研究
目的建立实验室大劣按蚊自然交配繁殖种群,为同类研究提供依据.方法将野外捕捉并在实验室人工交配繁殖至第61代的大劣按蚊,按不同雌雄比例先后顺序置于大、中、小三种不同型号的蚊笼中喂养、驯化、观察产卵情况并计算产卵数和孵化率.结果在大、中、小蚊笼内的分别驯化至第15、10和18代时成蚊卵的孵化率各达到82%、83.4%和80.7%,成功建立小蚊笼自然交配的大劣按蚊种群.结论经实验室驯化的大劣按蚊能够自然交配、产卵、繁殖,有助于建立实验室自然种群.
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大劣按蚊TEP1 cDNA的克隆和生物信息学分析
目的 克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)含硫酯键蛋白1(thioester-containing protein 1,TEP1)的cDNA,并分析其序列.方法 根据已报道的冈比亚按蚊等多种昆虫的TEP1氨基酸保守序列设计简并引物,以大劣按蚊血淋巴细胞总RNA为模板,进行RT-PCR扩增.对目的 片段纯化回收,经TA克隆后测定其核苷酸序列.利用DNASIS程序分析该序列,并推导其氨基酸序列,后利用BLAST和DNASIS等进行不同昆虫TEP1氨基酸序列的比对.结果 RT-PCR扩增出一约770 bp的条带,TA克降后DNA测序发现,阳性克隆的核苷酸序列长774 bp,推导其氨基酸序列长258 aa.生物信息学分析表明,该序列与冈比亚按蚊、阿拉伯按蚊、斯氏按蚊TEP1基因的氨基酸序列同源性分别达72%、72%和59%,与冈比亚按蚊的TEP4氨基酸序列同源性为59%.结论 从大劣按蚊血淋巴细胞中成功克隆出了TEP1的cDNA部分序列.
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大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶的交叉免疫活性
目的 探讨大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶之间是否存在交叉免疫反应性.方法 首先利用生物信息学方法分析不同昆虫间丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的保守性,尤其是大劣按蚊与烟草天蛾间丝氨酸蛋白酶的序列相似性;然后,PinPoint Xa-1表达载体对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行体外原核表达,利用Western blot方法检测表达产物与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清之间的免疫反应性.结果 生物信息学分析结果显示,不同昆虫间(包括大劣按蚊与烟草天蛾)丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有较高保守性;成功进行了大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的体外原核表达,western blot结果显示,烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清能够能够识别表达产物.结论 大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶具有交叉免疫活性,利用烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶是可行的.这将为下一步从蛋白水平研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的生物学特性奠定基础.
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大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究
目的 探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶（PO）与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法 以大劣按蚊/约氏疟原虫模型，利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法，比较、分析血餐后5、7、11、15 d时不吸血组、吸正常血组和感染组3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶（MPO）和双酚氧化酶(o-DPO)活性；同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果 感染组的血淋巴MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组（P<0.05）；但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高，感染组血淋巴MPO和o-DPO活性逐渐下降。另外，吸正常血组的MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组（P<0.05）。结论 吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应，而大劣按蚊血淋巴酚氧化酶可能在大劣按蚊对黑化约氏疟原虫卵囊中发挥重要作用。
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感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白分析
目的获得并分析感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白.方法利用二维电泳方法分别分离感染约氏疟原虫前后的大劣按蚊血淋巴蛋白,进行考马斯亮蓝染色,并利用PDQuest 2D Elite软件分析和比较凝胶结果;对感染约氏疟原虫前后的差异表达蛋白进行质谱分析,获得肽质量指纹图谱;利用Mascot软件系统,在Swiss-Prot等数据库中检索和分析所获得的肽质量指纹图谱.预测差异表达蛋白的生物学特性和在卵囊黑化中的功能.结果获得了分辨率和重复性均较好的二维电泳图,感染组凝胶可见120个蛋白点,正常组凝胶可见95个蛋白点,二者比较分析后发现有37个差异蛋白点;质谱分析获得3个肽质量指纹图谱,于蛋白数据库检索后未发现匹配分值很高的相关蛋白,其中差异蛋白点1与冈比亚按蚊一蛋白具有较高的同源性.结论获得了感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异蛋白和部分差异蛋白的相关信息,这为从蛋白水平认识蚊媒和疟原虫的相互关系和更深入地利用大劣按蚊-约氏疟原虫模型开展卵囊黑化的相关研究奠定了基础.
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大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建与质量鉴定
目的构建大劣按蚊成蚊cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊免疫及疟原虫发育相关基因奠定基础.方法分离大劣按蚊成蚊mRNA,用Stratagene公司的ZAP Express文库构建试剂盒构建cDNA文库并鉴定其质量.结果所建文库滴度达2.1×106 pfu/ml,重组效率达98%以上,插入片段长度平均为1 kb以上. 结论采用ZAP Express文库构建试剂盒可以成功构建出较高质量的大劣按蚊成蚊cDNA文库.
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吸血和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中rpS7转录的影响
目的观察血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中核糖体蛋白S7(Ribosomal protein, rpS7)转录的影响.方法同批3～5 d龄大劣按蚊分为正常组(N)、吸正常血组(B)和感染约氏疟原虫组(I),分别在血餐后1、2、3、7 d,离心法同时收集3组各50只雌大劣按蚊血细胞总RNA,所有样品进行RT-PCR后,各吸取10ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统扫描并读取数据,并对所得数据进行统计学分析.结果 3组大劣按蚊血细胞rpS7 mRNA 的RT-PCR扩增产物量无显著差异(P>0.05). 结论类似于人类和小鼠β- actin,以及冈比亚按蚊rpS7,大劣按蚊血细胞rpS7可作为从分子水平研究大劣按蚊抗约氏疟原虫感染防御相关因子的内参照.
关键词： 大劣按蚊 约氏疟原虫 核糖体蛋白S7(rpS7) -
约氏疟原虫卵囊黑化期间大劣按蚊血淋巴蛋白的分析
目的初步探讨大劣按蚊(Anopheles dirus) 黑化包被约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)卵囊相关蛋白.方法挤压法分别收集血餐后第1、3、4、5天时不吸血组、吸正常血组和感染组的雌大劣按蚊血淋巴,经SDS-PAGE分离后,银染显色.同时,用烟草天蛾(Manduca Sexta)前酚氧化酶(Prophenoloxidase, PPO)亚基1 IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴中的PPO.结果 SDS-PAGE发现感染约氏疟原虫后,部分大劣按蚊的血淋巴蛋白带增强,而部分血淋巴蛋白带却减弱,免疫印迹发现大劣按蚊血淋巴PPO有87×103、67×103、63×105 3条蛋白带,而相应分子量的3条蛋白带在约氏疟原虫感染后第4、5天开始增强,其中尤以87×103的增强为明显.结论大劣按蚊在对约氏疟原虫卵囊黑化包被期间诱导合成的某些血淋巴蛋白与前酚氧化酶级联反应主要成分有关联.
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大劣按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究
目的探讨大劣按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化的相互关系.方法将雌大劣按蚊成蚊分为吸糖水组、正常小白鼠血组和约氏疟原虫感染血组,以挤压法收集各组的血淋巴,解剖中肠并利用超声波提取其蛋白,继而对血淋巴和中肠蛋白进行SDS-PAGE分离,Western blot检测丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶的表达差异,并利用免疫组织化学进行血细胞丝氨酸蛋白酶与前酚氧化酶的定位检测.结果 SDS-PAGE显示吸糖水大劣按蚊有34条蛋白带,而吸正常小鼠血和吸感染血蚊血淋巴有35条蛋白带,而且在分子量约160×103和66×103的蛋白差异带显著,吸正常血及感染血后表达增强.吸糖水和吸正常小白鼠血组血淋巴丝氨酸蛋白酶呈现2条带,分子量分别约160×103和150×103,3组蚊血淋巴前酚氧化酶呈现1条带,分子量约66×103,吸正常小鼠血和吸感染血组蚊1 d后血淋巴丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶表达均显著上调,尤其疟原虫感染后表达强.感染1 d后中肠前酚氧化酶带型明显增宽.免疫酶化学显示,丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶在血细胞内均呈颗粒状分布,血细胞外血淋巴液内有少许散在颗粒分布.结论约氏疟原虫卵囊黑化期间,大劣按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶表达增强,提示二者可能参与了卵囊黑化包裹反应.
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大劣按蚊AdPPO2、AdPPO3基因cDNA克隆与组织定位
目的克隆大劣按蚊PPO基因家族新成员的cDNA部分序列,并对所克隆基因进行蚊体组织定位研究.方法根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT-PCR扩增、目的片段克隆入T载体,然后,用PCR方法筛选新的PPO克隆并测序;以RT-PCR方法分析AdPPO2和AdPPO3在蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况.结果 AdPPO2和AdPPO3基因cDNA部分序列长均为597 bp,编码199个氨基酸;它们在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有分布.结论从大劣按蚊成功克隆获得2种新的PPO基因家族成员的cDNA部分序列,为进一步克隆其全序列奠定了基础.
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约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化
目的比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)的分布及其变化,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系.方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠.利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析.结果斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带,分子量约为67×103,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显.结论约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关,并可能具有重要的生理学意义以及与激活按蚊抗疟原虫感染的免疫防御反应相关.
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约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO4基因转录与卵囊内Ca2+的影响
目的观察约氏疟原虫感染对大劣按蚊前酚氧化酶(prophenoloxidase, PPO)基因转录的影响与卵囊黑化期间囊内Ca2+的变化,探讨疟原虫感染不易感蚊种时卵囊黑化的相关机制.方法分别在大劣按蚊吸血感染约氏疟原虫前与感染后1、2、3和5 d抽提蚊总RNA进行RT-PCR,PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后扫描进行凝胶图像分析,并对所得数据进行统计学处理.在吸血感染后5、7、11和15 d解剖分离按蚊中肠,以荧光染料Fluo-3/Am作为卵囊内Ca2+指示剂,利用共聚焦扫描显微镜观察不同时期约氏疟原虫卵囊内Ca2+的分布及变化.结果吸血感染约氏疟原虫前大劣按蚊PPO4基因的RT-PCR扩增产物较少,但感染后明显增加(P<0.01),尤其在感染后1 d与2 d为明显;约氏疟原虫未黑化卵囊内Ca2+为(137.15±7.02) nmol/L,完全黑化卵囊内Ca2+为(18.44±1.75) nmol/L、并在囊壁出现明显的钙沉着.结论吸血感染约氏疟原虫后大劣按蚊PPO4基因转录比感染前明显增强,黑化卵囊内Ca2+较未黑化卵囊明显减少,并有外排现象.
关键词： 大劣按蚊 约氏疟原虫 前酚氧化酶基因(PPO4) 卵囊 Ca2+ -
吸血和约氏疟原虫感染对AdPPOs基因家族转录水平的影响
目的观察血餐和约氏疟原虫感染对AdPPO1、AdPPO2和AdPPO3基因转录水平的影响.方法同批3～5 d龄大劣按蚊分为不吸血组(N)、吸正常血组(NB)和吸感染血组(IB),在血餐后24 h分别制备各组蚊总RNA,所有样品进行RT-PCR后,各吸取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统扫描并读取数据,并对所得数据进行统计学处理.结果与不吸血组比较,吸血组和感染组AdPPO1的转录水平显著下降(P<0.05),但吸血组和感染组间没有显著性差异(P>0.05).吸血组AdPPO2的转录则明显上调(P<0.05),但与感染组间没有显著性差异(P>0.05);AdPPO3基因的转录水平在3组间均没有显著性差别(P>0.05).结论血餐明显抑制AdPPO1基因的转录,但明显上调AdPPO2基因的转录水平;约氏疟原虫感染后24 h,AdPPO1,AdPPO2和AdPPO3基因的转录水平均不受影响.
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约氏疟原虫感染诱导大劣按蚊AdSP1 和AdSP3的转录
目的观察丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊主要组织中的表达,分析血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞AdSP1 和AdSP3转录的影响.方法离心收集血细胞,解剖分离大劣按蚊蚊胃和唾液腺,提取相应的总RNA,RT-PCR扩增;然后将同批3～5 d龄大劣按蚊分为正常组(N)、吸正常血组(B)和感染约氏疟原虫组(I),分别在血餐后1、2、3、4、7 d和11 d,收集3组各50只雌大劣按蚊血细胞和提取总RNA,以Ads7为内参照,进行半定量RT-PCR分析.结果丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊血细胞和唾液腺中表达,不在蚊胃表达;吸血和约氏疟原虫感染后,大劣按蚊血细胞中AdSP1 和AdSP3的转录上调,尤以约氏疟原虫黑化期间明显.结论 AdSP1和AdSP3可能参与大劣按蚊对约氏疟原虫的黑化反应,并可能是大劣按蚊的PPAE.
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大劣按蚊对约氏疟原虫卵囊黑化相关血细胞类型的初步鉴定
目的鉴定与抗疟黑化反应相关的大劣按蚊血细胞.方法采用姬氏染色法初步鉴定大劣按蚊血细胞类型,继而利用免疫细胞化学技术检测大劣按蚊血细胞内前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶.结果颗粒细胞和浆细胞为大劣按蚊主要血细胞,前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶也主要分布于颗粒细胞和浆细胞内,其中颗粒细胞常见.结论抗疟黑化相关性血细胞可能主要为颗粒细胞和浆细胞.
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AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析
目的克隆大劣按蚊(An dirus)前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列,然后进行序列查询与比对.结果从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长597 bp,编码199个氨基酸;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84%和90%.结论从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列,与冈比亚按蚊PPO4基因具有很高的同源性.
