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脂质体RNAiMAX介导siRNA转染沉默星形胶质细胞AQP4基因
目的 明确脂质体RNAiMAX(lipofectamine RNAiMAX)是否可以介导小干扰RNA(siRNA)转染入原代培养星形胶质细胞并实现水通道蛋白4(AQP4)基因沉默.方法 利用原代培养的Wistar大鼠大脑皮层星形胶质细胞,通过倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪,观察lipofectamine RNAiMAX是否能介导Cy3标记的siRNA转染入细胞内,以及RNAiMAX浓度和siRNA浓度对转染效率的影响;利用Real-time PCR方法检测AQP4 siRNA转染的基因沉默效果.结果 倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪检测发现,随着siRNA和RNAiMAX浓度的增加,转染细胞荧光强度随之增加(n=6);Real-time PCR检测结果显示,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA以及6ml/LRNAiMAX和60nmol/L AQP4 siRNA转染星形胶质细胞24h、48h、72h时,AQP4 mRNA水平均降低80％以上(n=6).结论 Lipofectamine RNAiMAX可以介导siRNA转染入原代培养星形胶质细胞中并实现AQP4基因的沉默,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA即可达到理想的沉默效果.
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胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA表达载体的构建及其对胃癌细胞的影响
目的 探讨胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA(siRNA)转染对胃癌细胞MKN45的影响.方法 设计两对针对GCRG213可转录为siRNA的DNA片段,退火后插入siRNA表达载体IMG-800.测序正确的重组子IMG-800-1(含干扰片段1)、IMG-800-2(含干扰片段2)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.采用半定量RT-PCR及Western免疫印迹法,比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异.选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin V FITC/PI双标记法检测凋亡细胞,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 经测序证实,干扰片段退火后正确插入小干扰RNA表达载体IMG-800,组成重组子IMG-800-1和IMG-800-2.重组子IMG-800-1、IMG-800-2和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示,转染siRNA的MKN45细胞中,mRNA的表达分别下调44.9%和49.5%;Western印迹法结果显示,转染siRNA的MKN45细胞中,蛋白的表达分别下调55.3%和64.2%.与转染空载体的细胞相比,转染siRNA的MKN45细胞生长增殖速度明显减慢,细胞周期表现为处于G0～G1期的细胞有所增加,G2/M期和(或)S期的细胞比例减少,细胞凋亡率增加,细胞克隆形成数量减少,裸鼠体内成瘤性降低.结论 胃癌相关基因GCRG213 siRNA转染,可抑制肿瘤细胞的生长和增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的成瘤性.
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XB130基因对肝细胞癌细胞增殖的影响及其机制
背景与目的:XB130蛋白在肿瘤细胞增殖和侵袭中有重要作用,但在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的研究却极少,其作用至今仍不清楚.该研究拟探讨XB130基因对HCC细胞增殖能力的影响及其可能的下游机制.方法 :采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测HCC细胞系Huh7、HepG2、 SNU449及正常肝脏细胞系HL7702内XB130蛋白的表达.将XB130-siRNA转染Huh7细胞后,采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测Huh7细胞活性,流式细胞术检测Huh7细胞周期,Western blot检测 p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb的蛋白表达水平,反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测E2F/DP-1的靶基因cyclin E1、c-Myc及PCNA的mRNA表达水平.结果 :XB130蛋白在Huh7、HepG2、SNU449和HL7702细胞中的相对表达量分别为0.66±0.10、0.78±0.11、0.83±0.08和 0.32±0.06,各HCC细胞与HL7702细胞的差异均有统计学意义(P均＜0.01).XB130-siRNA转染可成功抑制 Huh7细胞中XB130蛋白的表达.沉默XB130后,Huh7细胞活性在72 h后明显减弱(P＜0.001),48 h后G0/G1期细胞比例升高,S和G2/M期细胞比例降低(P均＜0.01),p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb的蛋白表达下降 (P均＜0.01),cyclin E1、c-Myc及PCNA的mRNA表达下降(P 均＜0.001).结论 :XB130通过对细胞周期蛋白及下游转录因子的调控,影响HCC细胞增殖.
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siRNA抑制鼻咽癌细胞CXCL8基因表达的研究
研究siRNA下调鼻咽癌CXCL8基因表达后对其肿瘤细胞生物学特性的影响.通过化学合成siRNA序列,并转染至鼻咽癌细胞CNE,用qPCR方法检测其干扰效果.在用ELISA方法确认蛋白下调后,通过CCK-8实验进一步研究细胞增殖能力的改变.数据显示,siRNA-2转染组可有效下调CXCL8基因的表达,mRNA干扰效果为(71±2)％,CXCL8下调至(25.3±3.1)pg/mL,同时细胞增殖能力明显下降.
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siRNA靶向干扰IL28RA基因对缺氧复氧心肌细胞损伤的保护作用
目的:探讨小干扰RNA (small interference RNA,siRNA)靶向干扰白细胞介素28受体α(interleukin 28 receptor alpha,IL28RA)基因对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用.方法:设计合成干扰IL28RA基因表达的3对siRNA(siRNA-6158、siRNA-6160、siRNA-6162),采用脂质体转染原代乳大鼠心肌细胞,分为正常对照组、单纯缺氧复氧组、缺氧复氧+阴性对照转染组、缺氧复氧+siRNA-6158转染组、缺氧复氧+siRNA-6160转染组、缺氧复氧+siRNA-6162转染组,探索siRNA转染心肌细胞的合适浓度,检测心肌细胞存活率、培养液中LDH的水平及心肌细胞IL28RA蛋白表达,观察siRNA干扰IL28RA基因对心肌细胞缺氧复氧过程中的保护作用.结果:采用脂质体转染法,siRNA浓度在80 nmol/L对心肌细胞具有较高的转染效率.与单纯缺氧复氧组和缺氧复氧+阴性对照转染组比较,缺氧复氧+siRNA-6158转染组和缺氧复氧+siRNA-6160转染组的LDH活性明显降低(P＜0.05),心肌细胞存活率明显升高(P＜0.05),IL28RA蛋白表达明显减少(P＜0.05).结论:干扰IL28RA基因的表达有望成为保护缺氧复氧心肌损伤的重要手段.
关键词： 白细胞介素28受体α siRNA转染 缺氧复氧 心肌细胞 心肌损伤
