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巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1在大鼠2型星形胶质细胞中的表达
目的 观察1型和2型星形胶质细胞(T1A、T2A)是否表达神经干细胞的标志物、是否具有神经干细胞的特性.方法 取新生大鼠脑皮质,体外培养纯化的O-2A祖细胞、T1A和T2A,应用激光共焦双重免疫荧光标记技术检测巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)的表达;观察O-2A祖细胞、 T1A和T2A在碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的培养液中生长方式的改变.结果 巢蛋白在O-2A祖细胞和T2A中表达,T1A不表达;SSEA-1仅在T2A中表达.在干细胞培养基中培养10d,T2A形成能增殖和连续传代的细胞球,细胞球巢蛋白标记阳性,贴壁后分化细胞具有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞样形态;但相同培养条件下的O-2A祖细胞和T1A生长方式无改变.结论 巢蛋白和SSEA-1在两型星形胶质细胞中的表达存在差异,T2A具有神经干细胞的某些生物学特性.
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缺氧缺血对O-2A祖细胞膜铁转运蛋白1表达的影响
目的 观察膜铁转运蛋白1(FPNl)在O-2A祖细胞缺氧缺血损伤后的表达变化,探讨其在O-2A祖细胞缺氧缺血损伤中的作用.方法 体外培养O-2A祖细胞,以特异性抗体A2B5鉴定,观察FPN1在O-2A祖细胞上的定位表达；以糖氧剥夺(OGD)法建立缺氧缺血细胞模型,CCK8法检测细胞存活率；应用免疫荧光染色法、实时荧光定量PCR法和Western blotting法观察FPN1在细胞缺氧缺血后的表达变化.结果 FPN1定位表达于O-2A祖细胞的细胞膜、细胞质和突起；OGD3h、6h、12h及24h细胞存活率呈时间依赖性降低(P＜ 0.05);OGD12h内细胞FPN1免疫荧光强度进行性减弱；与OGD0h相比,FPN1 mRNA和蛋白水平在OGD3h表达下调,OGD6h进一步降低,OGD12h低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 O-2A祖细胞缺氧缺血损伤后FPN1表达明显下调,细胞存活率显著降低,提示FPN1可能参与O-2A祖细胞的缺氧缺血损伤过程.
关键词： 膜铁转运蛋白1 缺氧缺血 实时定量-聚合酶链反应 免疫印迹法 O-2A祖细胞 -
少突胶质谱系细胞的生物学特性
目的 研究少突胶质谱系细胞定向分化过程中的增殖及形态学的变化,为进一步研究脑室周围白质软化的临床治疗奠定基础.方法 依据各种胶质细胞黏附性及生长时间的差异,通过机械振荡法和差速贴壁法从原代培养中获得纯化的O-2A祖细胞,接种于含有血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液观察其增殖情况,再以三碘甲状腺原氨酸和睫状神经营养因子定向诱导分化,并观察分化过程中细胞的形态学变化,免疫细胞化学鉴定.结果 纯化的O-2A祖细胞接种后指数式增殖呈团,细胞界限不清,表达NG2,至第4天细胞不再增多进入分裂终期;进入分化过程的少突胶质谱系细胞突起逐渐分级、交互,免疫化学鉴定依次表达O4、GalC及MBP.结论 O-2A祖细胞具有良好的增殖能力,沿着少突胶质谱系细胞定向分化伴随形态学及表面表达抗原的变化.
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少突胶质细胞发生过程中S-100β表达的变化
目的:探讨少突胶质细胞发生过程中3个主要不同阶段S-100β的表达.方法:采用振荡法和差速贴壁法,获得纯化的O-2A祖细胞;双重免疫荧光细胞化学显色法观察S-100β在少突胶质细胞发生过程中的表达情况.结果:O-2A祖细胞在含有碱性成纤维细胞因子(10 ng/ml)和血小板源性生长因子(10 ng/ml)培养液中培养48 h,不表达S-100β;换成含有3'碘甲状腺原氨酸(30 ng/ml)培养液继续培养24 h,S-100β免疫反应呈现阳性.前少突胶质细胞、少突胶质细胞中表达S-100β.结论:少突胶质细胞发生过程中S-100β的表达始于O-2A祖细胞过渡到前少突胶质细胞之间,可能与其从多潜能分化阶段过渡到形态学上的分化阶段有关.
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少突胶质谱系细胞易损性的研究
目的:研究TNF-α对O-2A祖细胞、原少突胶质细胞、少突胶质细胞(oligodendrocytes,OL)这三个不同发育阶段少突胶质谱系细胞的易损性.方法:采用TNF-α分别刺激这三个不同发育阶段的细胞,MTT法检测存活率,免疫细胞化学检测活化的caspase-3.结果:O-2A祖细胞与OL相比存活率明显降低,原少突胶质细胞与OL相比存活率也降低;50 ng/ml TNF-α刺激少突胶质谱系细胞48 h以内,O-2A祖细胞的存活率与原少突胶质细胞、OL的存活率相比差异无统计学意义,而原少突胶质细胞的存活率与OL存活率相比较明显降低;caspase-3免疫细胞化学染色显示在这些细胞的胞浆和胞核有大量阳性信号.结论:TNF-α降低少突胶质谱系细胞的存活率具有细胞成熟程度的依赖性;caspage-3参与TNF-α诱导的3个不同发育阶段的OL的凋亡.
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O-2A祖细胞移植对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的作用
目的 研究O-2A祖细胞移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后运动功能恢复的作用.方法 从新生1～2 d SD大鼠大脑皮质中分离纯化O-2A祖细胞.80只SD成年大鼠,随机分为4组:A组为正常组,与其他3组同期饲养;其他3组均行T9脊髓左半侧离断手术,B组损伤处植入吸附生理盐水的明胶海绵(损伤对照组);C组损伤处移植50%O-2A祖细胞和50%1型星形胶质细胞(T1A)混悬液(O-2A+T1A组);D组损伤处植入含有纯化O-2A祖细胞的细胞悬液(O-2A移植组).移植术后3、7、14、21、28 d分别以CBS及BBB方法 进行大鼠神经功能评定.结果 A组大鼠后肢CBS和BBB得分分别为100和21.O-2A祖细胞移植术后3、7、14、21、28 d,B、C、D组动物后肢神经功能均有不同程度的恢复,左后肢得分均显著低于右侧,差异均有高度统计学意义(均P<0.01),D组运动功能恢复好.结论 O-2A祖细胞移植可促进大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复.
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新生大鼠大脑O-2A细胞系的分离纯化和双向分化培养
目的在体外培养条件下获取纯度较高的O-2A细胞系细胞并探索其分化规律.方法根据星形胶质细胞、O-2A祖细胞的生长时间差异及细胞的粘附特性不同,采用振荡法和差速贴壁法,结合1型星形胶质细胞条件培养液,培养、分离纯化O-2A祖细胞.结果纯化的O-2A祖细胞胞体呈椭圆形,具有典型的双极突起;经免疫细胞化学染色鉴定,细胞的纯度达90%.在有血清的情况下,O-2A祖细胞定向分化为2型星形胶质细胞;在无血清的情况下,定向分化为少突胶质细胞.结论通过振荡法和差速贴壁法,结合1型星形胶质细胞条件培养液分离纯化培养的O-2A祖细胞具有双分化潜能.
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新生小鼠视神经少突胶质细胞系定向分化培养及鉴定
目的探索P2期小鼠视神经少突胶质细胞的分化规律.方法经颅开眶法获取P2期小鼠管内段视神经2 mm,组织块法培养,振荡法分离纯化,化学限定性培养基定向分化培养纯化,免疫细胞化学方法鉴定,流式细胞仪检测纯度.结果混合胶质细胞原代培养7 d时细胞分层,少突胶质细胞前体细胞(O-2A)分散于星形细胞层上,分离后的O-2A祖细胞抗神经节苷脂GD3阳性;无血清甲状腺素限定性培养基定向培养2周后O-2A祖细胞分化为MBP阳性成熟的少突胶质细胞细胞.结论组织块法培养、振荡法分离纯化P2期小鼠视神经少突胶质细胞前体细胞,纯度高.O-2A祖细胞可分化为成熟少突胶质细胞.
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新生大鼠大脑皮质O-2A祖细胞的体外诱导分化
目的在获取高纯度O-2A祖细胞的基础上,探讨O-2A祖细胞在体外分化的形态学特点.方法采用"两次恒温摇床振荡法"和差速贴壁法,结合使用神经营养因子(bFGF、PDGF-AA),进行O-2A祖细胞体外纯化和扩增培养,并观察O-2A祖细胞在有血清和无血清培养条件下的分化情况,用免疫细胞化学鉴定分化成熟的2型星型胶质细胞和少突胶质细胞.结果培养的O-2A祖细胞能形成克隆球,具有增殖能力,经免疫细胞化学鉴定细胞纯度达90%以上.在含血清的培养基中能定向分化为2型星形胶质细胞,其胞体较大,从胞体上伸出细长突起,由突起上再发出更为细小的分支,GFAP和A2B5抗体标记均为阳性;在无血清的化学条件培养基中能定向分化为少突胶质细胞,其胞体较小,突起短而细,相互交织呈"蜘蛛网"样,CNPase抗体标记阳性.结论(1)培养的O-2A祖细胞保持定向干细胞的特性,具有增殖和双向分化的潜能;(2)O-2A祖细胞定向分化为2型星形胶质细胞过程中经历较长的增殖期,而分化为少突胶质细胞过程中则增殖期较短;(3)分化的2型星形胶质细胞和少突胶质细胞在形态学和抗原表达上存在差异.
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体外培养获取高纯度O-2A祖细胞
目的获取较高纯度的O-2A祖细胞,并观察在不同的实验条件下O-2A祖细胞的分化作用.方法根据星形胶质细胞、O-2A祖细胞的生长时间差异,细胞的粘附特性不同,采用振荡和差速贴壁法结合Ⅰ型星形胶质细胞条件培养液,培养、分离纯化O-2A祖细胞.结果培养的O-2A祖细胞胞体呈椭圆形,有典型的双极突起,少数呈三极突起;经免疫组织化学染色鉴定细胞的纯度达90%.在有血清的情况下,O-2A祖细胞定向分化为Ⅱ型星形胶质细胞;在无血清的情况下,其定向分化为少突胶质细胞.结论通过振荡法和Ⅰ型星形胶质细胞条件培养液结合差速贴壁法分离纯化培养O-2A祖细胞是一种可行的培养方法.
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电离辐射对离体培养O-2A祖细胞分化的影响
背景与目的:电离辐射引起中枢神经系统脱髓鞘病变的主要靶细胞之一为O-2A祖细胞,其在体外可定向诱导分化为少突胶质细胞和Ⅱ型星形胶质细胞.本文旨在探索电离辐射对O-2A祖细胞分化的影响,为研究早期放射性脑损伤发病机理的研究提供实验基础.方法:利用新生SD大鼠脑混合胶质细胞原代培养、定向诱导分化和免疫细胞化学等技术,观察不同辐射剂量对O-2A祖细胞分化的影响,检测其数量、形态和分化比例的情况.结果:倒置显微镜下计数对照组O-2A祖细胞个数为24.80±3.70,照射2 Gy、10 Gy30Gy组分别为4.40±0.89、1.60±0.55、1.20±0.45,与对照组相比照射后O-2A祖细胞总数明显减少(P＜0.001);10 Gy、30 Gy组中诱导分化的少突胶质细胞和Ⅱ型星形胶质细胞的突起变粗变短,但各组间细胞分化比例未见明显变化(P＞0.05).结论:电离辐射对O-2A祖细胞的分化有较大影响,影响程度与辐射剂量存在量效关系.
