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siRNA靶向抗酶抑制剂下调前列腺癌细胞PC3中鸟氨酸脱羧酶表达
目的 探讨抗酶抑制剂(AZIN)对前列腺癌细胞PC3鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达水平及增殖的影响.方法 将siRNA-AZIN转染前列腺癌PC3细胞,分别用RT-PCR及Western blot检测抗酶(AZ)、AZIN及ODC在mRNA和蛋白水平的表达,MTT检测细胞增殖.结果 siRNA-AZIN转染前列腺癌PC3细胞后,AZIN RNA表达水平降低(P<0.01);PC3细胞AZIN蛋白表达水平降低(P<0.05),且使ODC的表达水平降低(P<0.05);PC3细胞增殖能力明显减弱(P<0.05).结论 siRNA-AZIN可下调前列腺癌细胞PC3中ODC的表达.
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皮质酮对大鼠早期再生肝抗酶mRNA及蛋白表达的影响
目的 研究外源皮质酮对部分肝切除(PH)诱导的大鼠早期再生肝抗酶mRNA及蛋白水平的影响.方法 PH前3d对成年雄性SD大鼠进行双侧肾上腺切除术,皮质酮悬浮于芝麻油中皮下注射去肾上腺鼠,抗酶mRNA及其蛋白水平的测定采用RT-PCR和Western blotting法. 结果 与对照组(n=6,以下相同)相比,去肾上腺组及10mg/kg、20mg/kg体重皮质酮处理组抗酶mRNA水平变化不明显,而40mg/kg体重皮质酮处理能显著刺激其转录.在PH后5、7、9h,去肾上腺术鼠抗酶蛋白水平显著低于相应时间点的对照组;皮质酮处理后,蛋白水平在所观察的整个实验过程中均显著上升,且剂量越高,蛋白含量越多,尤其在PH后5h,10、20和40mg/kg体重皮质酮处理组分别比同时间点对照组高43%、79%和93%. 结论 皮质酮对大鼠早期再生肝抗酶蛋白的合成具有剂量依赖性促进作用.
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外源精脒和精胺可诱导大鼠早期再生肝抗酶的表达
目的 探讨精脒和精胺对大鼠早期再生肝抗酶(AZ)表达的影响,及在肝再生中的作用. 方法 外源多胺(溶于0.9% NaCl)皮下注射雄性SD大鼠(180～200g),进行部分肝切除(PH)诱导.采用RT-PCR和Western blotting方法进行PH后大鼠再生肝中AZ基因转录量和蛋白表达量的分析.结果 对照组完整肝脏(PH后0h)中,AZ基因转录量、蛋白表达量较低,PH后均快速升高,3h达到峰值,5h出现明显下降,7h再次升高并达到峰值,之后缓慢下降.外源多胺处理后,两种剂量精脒(0.03mg/kg和 0.15mg/kg)和精胺(0.06mg/kg 和6mg/kg)处理组AZ mRNA及蛋白表达水平变化趋势与对照组相似,但低剂量处理组远远低于相应时间点高剂量处理组.精胺的作用效果更明显,作用时间更持久. 结论外源多胺对大鼠早期再生肝AZ mRNA及蛋白表达具有剂量依赖性促进作用,而精胺的作用较强,精脒较弱.
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抗酶抑制因子结构、功能与代谢的研究进展
抗酶抑制因子是一种热不稳定蛋白,与鸟氨酸脱羧酶同源,但不具有鸟氨酸脱羧酶活性,经泛素依赖途径被降解.抗酶抑制因子与抗酶高度亲和,抑制抗酶功能,恢复鸟氨酸脱羧酶活性.研究发现,抗酶抑制因子还能够调节多胺转运,抑制细胞周期蛋白D1的降解,以及加速中心粒复制,从而促进细胞增殖及肿瘤发生.
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抗酶的研究进展
抗酶(antizyme)是当细胞内多胺水平升高时刺激机体合成的一种小分子量调节蛋白,能特异性地与鸟氨酸脱羧酶 (ornithine decarboxylase, ODC) 结合,经泛素非依赖途径被26S蛋白酶体降解,从而使多胺合成减少;抗酶还可以调节多胺转运,以稳定细胞内多胺水平.近年来随着生物技术的不断发展,对抗酶的认识也逐步深入,本文综述了抗酶家族、合成、作用及定位等方面的研究进展.
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非泛素化蛋白降解体系靶向敲减KRAS癌蛋白的初步研究
目的：尝试构建能与KRAS癌蛋白相互作用的“RBD+ODC”融合蛋白，经由“鸟苷酸脱羧酶/抗酶”系统（onithine decarboxyl?ase/antizyme，ODC/AZ）在蛋白水平直接实现对KRAS癌蛋白的降解。方法：应用分子克隆的方法构建AZ、ODC、“RBD+ODC”、突变体“RBD+ODC”、突变体KRAS等真核表达质粒，分别瞬时转染人HEK293T和胰腺癌细胞PANC-1，应用Western blot法在蛋白水平直接检测外源性和内源性KRAS表达水平的改变，应用Co-IP法检测到“RBD+ODC”能够与KRAS癌蛋白相互作用。结果：成功构建了AZ、ODC、“RBD+ODC”、突变体“RBD+ODC”、突变体KRAS等多个真核表达质粒，相较于对照组，“RBD+ODC”能够在蛋白水平直接实现对外源性和内源性KRAS癌蛋白的“敲减”，并且能够与KRAS有效结合。结论：靶向敲减KRAS癌蛋白的非泛素化蛋白降解体系的构建，为下一步功能试验奠定了基础。
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外源性antizyme1基因转染对SH-SY5Y细胞的生物学影响
目的 研究antizyme 1(AZl)基因对成人神经廇SH-SY5Y细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.方法 将构建好的AZ1基因重组真核表达载体pAZ1m稳定转染SH-SY5Y细胞.通过MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞术分析AZ1转染对细胞周期及凋亡的影响.RT-PCR与Western blotting检测AZ1基因转染对cyclin D1和caspase-3表达的影响,caspase-3试剂盒检测酶活性变化.结果 稳定转染SH-SY5Y细胞后,检测结果显示AZ1基因转染能够减慢SH-SY5Y细胞增殖速度,并使细胞停滞于G0/G1期.在cyclin D1基因表达抑制的同时,caspase-3基因表达上调.酶活性测定显示Caspase-3活性上升.结论 AZ1基因能够抑制SH-SY5Y细胞增殖,通过降低cyclin D1的表达阻滞细胞周期于G0/G1期,并上调caspase-3表达促进SH-SY5Y细胞凋亡.
