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人rBPI23在大肠杆菌DH5α中的表达及其多克隆抗体的制备
目的 制备人rBPI23蛋白并免疫家兔获得特异性多克隆抗体.方法 将本室制备的pBV220-synBPI600表达载体转化感受态E.coli DH5α,温控诱导后,获得以包涵体形式表达的目的 重组蛋白;用SDS-PAGE鉴定分子质量,West-ern blot鉴定抗原性;免疫家兔获得抗rBPI23抗血清,经饱和硫酸铵沉淀获得多克隆抗体,间接法ELISA检测抗体效价,Western blot分析抗体的特异性.结果 重组蛋白主要以包涵体形式表达,SDS-PAGE显示其分子质量约23 ku,与预期结果相符;重组蛋白能与市售兔抗人BPI抗体特异性结合;免疫家兔获得高效价(1∶320000)抗血清,上述抗体能与rBPI23及人BPI标准品特异性结合.结论 成功制备了人rBPI23,免疫家兔获得高效价抗人rBPI23多克隆抗体,为制备单克隆抗体及后期建立BPI免疫学检测方法奠定基础.
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鲍曼不动杆菌外膜蛋白W多克隆抗体的制备及鉴定
目的：：制备鲍曼不动杆菌外膜蛋白W( OmpW)多克隆抗体，为进一步研究OmpW在鲍曼不动杆菌多重耐药及致病机制中的作用提供基础。方法：在Pubmed检索OmpW信息，选取外膜蛋白W特定的氨基酸区域合成多肽后偶联蓝色载体，并作为免疫原免疫新西兰大白兔，得到抗血清并进行纯化。采用5株鲍曼不动杆菌临床分离株的菌体蛋白对抗体进行鉴定。结果：偶联多肽的蓝色载体构建成功，经动物免疫后得到抗血清，经纯化后得到高纯度的OmpW多克隆抗体。经临床分离鲍曼不动杆菌菌体蛋白验证，证实得到理想的兔抗OmpW多克隆抗体。结论：通过多肽合成制备免疫原方法及动物免疫，成功获得了特异性高的多克隆抗体，为进一步研究鲍曼不动杆菌OmpW蛋白在不同鲍曼不动杆菌临床株中的分布特征及其抗体的保护效应奠定了基础。
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金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体的制备及鉴定
目的：制备金黄色葡萄球菌肠毒素A( SEA)多克隆抗体并用金黄色葡萄球菌野生株对其进行验证,为进一步研究SEA在金黄色葡萄球菌致病机制中的作用提供基础。方法：PCR方法扩增肠毒素A基因( sea),构建原核表达载体pET 30 a/sea,经PCR方法和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌DH 5α,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)和蛋白质印迹法( Western Bloting,WB)分析鉴定。蛋白经纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到抗血清并纯化,采用sea基因阳性的金黄色葡萄球菌野生株S 8和S 23株的菌体蛋白进行鉴定。结果：pET 30 a/sea重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中可实现高表达,纯化后得到高纯度的SEA蛋白,经临床分离金黄色葡萄球菌S 8和S 23株菌体蛋白验证,证实得到理想的兔抗SEA多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌SEA蛋白在构建的原核表达系统中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。
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重组羧肽酶原B甲醇酵母的构建与分泌表达
目的 构建重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株.方法 将羧肽酶原B编码基因整合入酵母质粒,电转化至甲醇酵母中,His缺陷培养基和G418抗性筛选获得阳性克隆株.用大肠杆菌表达的羧肽酶原B免疫家兔制备羧肽酶原B兔抗血清;经发酵、甲醇诱导后,蛋白质印迹(Western-blotting)免疫检测蛋白质的表达.结果 获得高抗体滴度的羧肽酶原B兔抗血清,蛋白质印迹免疫检测重组酵母经甲醇诱导表达后的上清阳性.结论 获得了重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株,可分泌表达重组羧肽酶原B.
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人睾丸特异表达基因PIAS-NY原核表达和多克隆抗体的制备
目的 构建PIAS-NY-pET30a原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY多克隆抗体.方法 以人精原cDNA文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增PIAS-NY开放阅读框,克隆到pET30a表达载体中,酶切、PCR鉴定构建重组质粒.测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行大量扩增,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.超声、离心、His-Ni柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY融合蛋白.分6次BalB/C小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白.2个月后小鼠眼球取血,收集血清.结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素变性后His-Ni柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY;6次免疫后收获存活小鼠抗血清;酶联免疫吸附测定(ELISA)抗血清滴度达到1:100000;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY抗血清能特异性识别293T细胞和GC2细胞中PIAS-NY蛋白.结论 成功获得PIAS-NY多克隆抗体,而且具有高反应性和高特异性,PIAS-NY在GC2细胞和293T细胞中表达,并且能够与RUVBL2蛋白发生相互作用.
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抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定
目的 激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein,KBP)具有抑制血管新生的高活性,但目前尚无KBP的特异性抗体,限制其进一步研究.本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估.方法 构建含大鼠源性KBP序列的pET-28a重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),在此基础上,扩增表达菌,经异丙基B.D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白.利用SDS-PAGE和Western blot方法对KBP进行鉴定.以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗KBP血清,亲和纯化获得多克隆抗体.应用Elisa和Western-blot方法检测纯化抗体的效价和特异性.结果 KBP融合蛋白得到高表达,且纯度大于85%.用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗KBP抗体,效价达1∶512 000,并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋白.结论以纯化的KBP重组蛋白为抗原,获得KBP多克隆抗体,具有较好的效价和特异性,为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具.
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抗人免疫球蛋白G的制备及其在免疫比浊中的应用
目的 纯化人IgG,制备兔抗人IgG多克隆抗体,用于配制IgG的免疫比浊定量诊断试剂.方法 用PEG-6000、辛酸沉淀、DEAE-Sepharose F.F离子交换层析纯化人IgG.纯化后的IgG免疫新西兰大白兔,并用相同方法纯化兔抗人IgG,配制IgG的免疫比浊定量诊断试剂并进行性能验证.结果 纯化的IgG纯度97%,收获率68.4%,配制试剂批内、批间CV分别为1.04%、2.62%,线性范围上限可达60.15 g/L,大干扰率为4.8%.结论 该纯化方法简单易行,收获率高,配制的试剂品质优良,精密度、准确度高,抗干扰能力强.
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HeLa细胞中Zwint-1选择剪接亚型v7的表达鉴定
目的：验证在HeLa细胞系中是否存在Zwint-1 v7选择性剪切亚型的mRNA和蛋白产物。方法：在缺失片段两侧设计引物，利用PCR和克隆测序验证HeLa细胞中是否存在缺失片段的mRNA；构建Zwint-1 v73′端特异区段(Z7)的GST融合表达载体pGEX-KG-GST-Z7，转化入BL21菌种诱导表达，菌体经超声破碎和2 mol/L尿素洗涤纯化，融合蛋白经SDS-PAGE电泳并切胶回收后作为抗原与佐剂混合乳化并免疫C57BL/6小鼠，收获多克隆抗血清Anti-Z7，采用Dot blot检测多克隆抗体的效价，Western blot检测HeLa细胞全蛋白中的Z7蛋白产物。结果：PCR和测序结果表明存在缺失37 bp的核酸片段；SDS-PAGE电泳显示在30.7 kDa处出现明显的蛋白条带；Dot blot结果表明1∶5000稀释的多克隆抗体能检出12 ng GST-Z7；Western blot结果表明，1∶200稀释的多克隆抗体可识别HeLa细胞中Zwint-1 v7蛋白。结论：本研究在核酸水平和蛋白水平初步验证了HeLa细胞中存在Zwint-1v7。
关键词： Hela细胞 Zwint-1v7蛋白 原核表达 多克隆抗体制备
