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野生冬虫夏草水提物体外抗HIV-1病毒作用的初步研究
研究分析野生冬虫夏草的水溶浸提物抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的效果及其抗病毒作用的靶点.研究分别选取新鲜虫体、子座、全草、干燥虫体和子座5种不同组分,获得水溶性提取物,采用CCK-8实验检测水提物的细胞毒性;假病毒单周期感染实验评价水提物的体外抗病毒活性;体外检测水提物对逆转录酶活性的影响,应用表面等离子共振(SPR)技术检测水提物与HIV-1 Vif蛋白的相互作用.这5种虫草水提物均具有显著的体外抗HIV-1病毒活性,抑制HIV-1逆转录酶的活性,新鲜子座水提物与Vif蛋白有良好的体外结合力.本实验明确了野生冬虫夏草的体外抗病毒活性,其作用机制可能与抑制逆转录酶活性和体外Vif蛋白有关,研究将为抗HIV-1病毒药物的研发提供实验基础.
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Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化
目的 获得高纯度的Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白.方法 以Vif/VR1o12质粒为模板,PCR扩增出Vif-△N28基因并插入pRSETB质粒.将构建的原核表达载体Vif-△N28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性.结果 所表达的Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上.结论 已成功构建了Vif-△N28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-△N28和Cullin5-N138蛋白.
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HIV-1 Vif蛋白的体内表达及其生物学功能
目的 分别构建带有6His和mbp tag的HIV-1 Vif基因真核表达载体,在体内表达融合蛋白,并检测其生物学功能.方法 PCR扩增带有6His和mbp tag的HIV-1 Vif基因,克隆至真核表达载体VRl012上.将抗病毒因子APOBEC3G(A3G)分别与空载体VR1012、HIV-1野生型Vif/VR1012、Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012共同转染293T细胞,检测Vif-mbp和Vif-6His的表达,并进行A3G体内降解试验.将A3G和/或可产生病毒的质粒HXB2Neo △ Aif分别与HIV-1野生型Vif/VR1012、Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012共同转染293T细胞,通过A3G包装进病毒和Magi细胞感染试验,进一步检测HIV-1 Vif-mbp和Vif-6His融合蛋白的生物学功能.结果 重组表达质粒Vif-mbp/VR1012和Vif-6His/VR1012经双酶切鉴定证明构建正确.转染293T细胞48 h后,Vif-mbp和Vif-6His融合蛋白均有表达,但表达的Vff-mbp有不同程度的降解.Vif-6His可降解A3G,使其表达量下降至10%左右,而Vif-mbp几乎不能降解A3G.Vif-6His可阻止A3G包装进病毒颗粒中,而Vif-mbp无此功能.Vif-mbp可使HXB2Neo △ Vif病毒感染能力恢复至15%,而Vif-6His可使其恢复至86%.结论 已成功构建了带有6His和mbp tag的HIV-1 Vif基因真核表达载体,表达的Vif-mbp融合蛋白影响了Vif的生物学功能,但Vif-6His融合蛋白不影响Vif的生物学功能.
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HIV-1 Vif与ElonginC蛋白在大肠杆菌中的共表达
目的 在大肠杆菌中共表达HIV.1Vif与ElonginC蛋白.方法 PCR扩增ElonginC基因全长DNA片段,克隆人pMDT-easy载体,经Nde I/BamH I双酶切后,与质粒pRSETB连接,构建质粒pRSETB-ElonginC.将质粒pMRI-Vif转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株,再将此菌株制备成感受态细胞.用pRSETB-ElonginC质粒转化该细胞,经1 mmol/L IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 质粒pRSETB-ElonginC经Nde I/BamH I双酶切,可切出约3 000和400 bp的2条片段,测序证明质粒构建正确.在大肠杆菌中共表达了Vif与ElonginC蛋白,该蛋白具有良好的抗原特异性.结论 在大肠杆菌中共表达了Vif与ElonginC蛋白.
关键词： 人类免疫缺陷病毒-1 Vif蛋白 ElonginC蛋白 原核共表达 -
HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究
目的 利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下凋,达到抑制vif蛋白表达的目的 ,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础.方法 通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK 293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证.结果 将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达.结论 RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究.
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APOBEC家族的防御机制
固有免疫是与生俱来的,从出生到死亡一直在起着重要的防御抵抗作用.当病原体对机体侵害时,免疫系统就去积极调动各个成员,比如抗菌肽,蛋白分解级联分子,信号转导分子如干扰素,还有专门的吞噬细胞等来一起抵御病原体.而事实上即使是单细胞生物的外膜和多细胞生物的上皮细胞表面也是固有免疫的防御系统,它们一直是对抗感染的屏障[1]
