首页 > 文献资料
-
MBP 不同cDNA序列真核表达载体的构建及鉴定
目的 以pEGFP-N1质粒载体为介导,构建针对髓鞘碱性蛋白(MBP)不同isoform cDNA的表达载体.方法 将三段不同MBP cDNA序列克隆入pEGFP-N1质粒,转化DH5α感受态细胞,酶切鉴定及测序.结果 测序结果 显示插入的三段目的 片段的序列与理论序列一致.结论 笔者成功构建了pEGFP-N1-MBP21.5,pEGFP-N1-MBP18.5和 pEGFP-N1-MBP17.3三个重组真核表达载体,为进一步研究不同MBP cDNA在真核细胞中的表达情况和功能差异奠定基础.
关键词： MBP cDNA 真核表达 pEGFP-N1质粒 载体构建 -
pEGFP-N1质粒转染乳鼠心肌细胞的分布及效率
目的: 研究pEGFP-N1质粒转染心肌细胞的分布及效率.方法: 培养乳鼠心肌细胞,根据乳鼠心肌细胞的不同生长时间(1～3 d)进行pEGFP-N1质粒转染心肌细胞的实验研究.结果: 乳鼠心肌细胞生长1 d时,pEGFP-N1质粒转染心肌细胞的效率显著高于乳鼠心肌细胞生长2 d、3 d时;pEGFP-N1质粒转染心肌细胞后EGFP均匀地充满胞浆和胞核.结论: pEGFP-N1质粒转染乳鼠心肌细胞的效率与心肌细胞的生长期有关;EGFP在心肌细胞中均匀分布于胞浆和胞核.
关键词： pEGFP-N1质粒 转染 心肌细胞 分布 转染效率 -
人HSP 40基因真核表达载体的构建及表达
目的 构建人热休克蛋白40(HSP40)的2种同源物HDJ-1和HDJ-2基因真核表达载体,观察其在人成神经细胞瘤细胞株(SK-N-SH)中的表达.方法 从流产胚胎脑组织中抽提总RNA,RT-PCR扩增HDJ-1和HDJ-2 cDNA,经限制性内切酶双酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)和pEGFP-N1质粒中.HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对,序列正确的重组质粒用脂质体转染SK-N-SH细胞, Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况.结果 HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致.Western blot证实pcDNA3.1(+)/HDJ-1转染SK-N-SH细胞24 h后有HDJ-1的过表达,至少持续72 h;pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞有HDJ-1/GFP和HDJ-2/GFP融合蛋白的表达,至少持续72 h.荧光显微镜观察到pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达.结论 本实验成功构建pcDNA3.1(+)/HDJ-1、pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2真核表达质粒,并在SK-N-SH细胞中表达.
关键词： HDJ-1 HDJ-2 pcDNA3.1(+)质粒 pEGFP-N1质粒 转染 -
HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究
目的 利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下凋,达到抑制vif蛋白表达的目的 ,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础.方法 通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK 293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证.结果 将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达.结论 RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究.
-
壳聚糖纳米细胞介导基因转染的研究
目的：构建核壳型壳聚糖（chitosan， CTS）纳米细胞（nanocell， NC），探讨其作为基因转染载体的可行性。方法以壳聚糖为载体材料， pEGFP-N1为模型质粒，制备质粒复合物pEGFP-N1/CTS-NP。以pEGFP-N1/CTS-NP为核心，用复乳法外包含十八胺（stearylamine， SA）的脂质体膜制备纳米细胞pEG-FP-N1/CTS-SANC，用CTS对其进行包覆制成CTS-（ pEGFP-N1/CTS-SANC），测定其形态、粒径与电位。用MTT法测定NC的细胞毒性，用荧光显微镜及流式细胞仪定性、定量地评价其在HeLa细胞中的转染率。结果所制备的样品多呈类球形，粒径与电位分别分布在120～220 nm与40～65 mV之间。 pEGFP-N1/CTS-SANC与CTS-（ pEGFP-N1/CTS-SANC）均可将质粒转染到HeLa细胞并表达绿色荧光蛋白。 CTS-（ pEGFP-N1/CTS-SANC）可降低pEGFP-N1/CTS-SANC的毒性，在相同质粒用量下，使HeLa细胞存活率从81．8％增至100．9％，转染率从3．90％增至8．13％，达市售脂质体转染试剂的76％。结论壳聚糖纳米细胞有望作为基因转染的载体。
-
变异链球菌luxS基因敲除重组质粒的构建
目的:构建一个含有抗卡那霉素基因和变异链球菌luxS基因上下游区同源序列的重组质粒,以便以后转化入变异链球菌进行luxS的敲除.方法:设计引物,以质粒pEGFP-N1为模板,进行PCR得到抗卡那霉素的DNA片断,再以变异链球菌的DNA为模板,PCR得到luxS基因上下游序列,后将这3 段DNA片断分别按顺序插入到pMD19-T载体的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,通过在卡那霉素和氨苄青霉素的培养基进行筛选.结果:kana+基因和luxS基因两侧同源序列成功连入到pMD19-T载体相应酶切位点,酶切、测序结果正确.结论:成功构建变异链球菌luxS基因敲除重组质粒,为将来构建变异链球菌luxS突变株打下基础.
