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温阳活血利水方含药血清对足细胞组织蛋白酶L、发动蛋白以及微丝、微管的影响
目的 探讨温阳活血利水方治疗原发性肾病综合征蛋白尿的可能作用机制.方法 将足细胞分为正常对照组、模型组、地塞米松组、10％中药血清组、20％中药血清组、空白对照组.除正常对照组、空白对照组外,其余各组用氨基核苷嘌呤霉素粉剂制备足细胞损伤模型.正常对照组和模型组加入完全培养基5 ml,地塞米松组加入392 μg/L地塞米松5ml,10％中药血清组、20％中药血清组、空白对照组分别加入10％中药血清、20％中药血清、空白对照血清各5ml.RT-PCR法与Western blot分别检测各组足细胞胞浆组织蛋白酶L (CatL)、发动蛋白mRNA和蛋白表达含量,并用激光共聚焦观察各组中足细胞骨架微丝、微管的形态结构变化.结果 与正常组比较,模型组CatL mRNA与蛋白含量升高,发动蛋白表达含量降低(P＜0.01);与模型组比较,各中药血清组与地塞米松组CatL mRNA与蛋白表达含量降低,足细胞发动蛋白蛋白表达含量升高(P＜0.01);与10％中药血清组比较,20％中药血清组CatL mRNA与蛋白表达含量降低,发动蛋白表达含量升高(P＜0.01).各组间足细胞发动蛋白mRNA表达含量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 温阳活血利水方可能通过下调足细胞CatL的表达,减少CatL对发动蛋白的酶解,从而稳定细胞骨架中的微丝、微管等结构,减少足突融合,改善蛋白尿.
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发动蛋白对心脏收缩-频率反应的调控作用
目的 观察DNM2在心脏收缩-频率反应(force-frequency response,FFR)中的作用.方法 分离培养大鼠心脏细胞.构建包含DNM2显性失活突变体的腺病毒载体,将其转染成年大鼠心室肌细胞,并分析DNM2功能失活对心肌细胞FFR的影响.通过免疫印迹方法检测受磷蛋白与钙—钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)的活性变化.用选择性药物抑制DNM2的GTP酶活性,观察离体心脏FFR的变化情况.结果 DNM2显性失活减弱了心肌细胞频率依赖的缩短分数和钙瞬变变化,这与细胞钙水平升高及CaMKⅡδ活性上调有关.器官层面的研究显示,抑制DNM2活性还可导致心脏FFR受到明显的损伤.结论 DNM2活性对心脏正常FFR的维持是必需的；作为调控FFR的重要分子,DNM2可能成为心力衰竭等心脏疾病的药物于预靶点.
关键词： 发动蛋白 收缩-频率反应 钙水平 受磷蛋白 钙-钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱδ -
癌基因CTTN表达Cortactin蛋白及其变异体磷酸化状态下与细胞蛋白Dynamin相互作用分析
目的:探讨Cortactin的氨基端序列在磷酸化介导的蛋白相互作用中的功能.方法:设计表达标签为GST的氨基端缺失的Cortactin突变体,纯化突变体蛋白,以及全长Cortactin蛋白,同时纯化His标签的细胞发动蛋白Dynamin,采用Src磷酸化Cortactin蛋白,并采用pull-down分析观察与Dynamin的相互作用.结果:成功表达和纯化Cortactin的1-80氨基酸(Cort△80)缺失、1-349缺失的Cortactin突变体(Cort△349),以及全长Cortactin (Cort WT)和Dynamin.Pull-down分析结果表明:与磷酸化的野生型Cortactin蛋白比较,氨基端缺失的Cortactin蛋白在磷酸化后与Dvnamin的结合作用减弱.结论:实验提示Cortactin分子的氨基端是Arp2/3与actin结合的重要结构域其参与肌动蛋白聚合的过程,对于磷酸化信号的正常传导是不可或缺的部分.
