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鹿茸中促大鼠成骨样细胞增殖活性组分的纯化与表征
目的:通过鹿血清白蛋白对大鼠成骨样细胞系UMR-106增殖活性和促胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)分泌水平的研究,为阐明鹿茸强筋健骨的作用机理及对骨质疏松的防治提供研究线索.方法:运用Sephacryl S-200HR凝胶色谱、POROS 20QE阴离子交换色谱和TSK G3000 SW高效液相色谱等分离手段,从冷冻干燥鹿茸粉粗提液中分离纯化得到鹿血清白蛋白.并用MTT法检测其对UMR-106细胞的增殖活性;用平衡饱和竞争放射免疫分析法(RIA)测定其促IGF-Ⅰ分泌水平.结果:经分离纯化得到的鹿血清白蛋白分子质量为56.3 kDa,在蛋白含量为0.149 μg·mL-1时,其促大鼠成骨样细胞增殖率为241.03%,IGF-Ⅰ分泌量为66.89 ng·mL-1.结论:鹿茸中的鹿血清白蛋白在14.9 ng·mL-1～14.90 μg·mL-1具有显著的促大鼠成骨样细胞增殖和IGF-Ⅰ分泌等活性.
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鹿茸粗提液对大鼠成骨肉瘤细胞增殖的调节作用
目的:观察鹿茸粗提液(PAE)对大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106增殖的影响,从而为研究鹿茸强筋健骨的分子机理以及筛选鹿茸防治骨质疏松的生物活性成分提供实验依据.方法:通过Sephacryl S-200HR凝胶过滤色谱对PAE进行初级分离,用MTT法检测不同分离组分对UMR-106细胞增殖的影响.结果:发现Sephacryl S-200HR凝胶过滤色谱第2峰P2次组分,当其蛋白质浓度高于0.972mg·L-1并低于97.2mg·L-1时,对UMR-106细胞增殖活性的影响表现为抑制;若浓度达到97.2mg·L-1后则会促进细胞的增殖,且增殖效应随蛋白质浓度的增加而明显上升.当样品蛋白质浓度达到9.72g·L-1时,相应的细胞增殖率为477.92%,接近PAE的增殖水平(499.62%).经SDS-PAGE电泳分析第2峰分子量集中于59kDa左右.此外,发现第3、第4和第5峰对UMR-106细胞增殖有显著的抑制作用.结论:鹿茸蛋白中含有多种双向调控UMR-106细胞增殖的生物活性因子,既有剂量双向效应,也有与分子量相关的不同调控蛋白,这对中药的双向调节作用提供研究线索.
关键词： 鹿茸粗提液(PAE) UMR-106细胞 细胞增殖 MTT法 -
Bcl2促进UMR-106细胞BMP-2、OPG表达及补肾健脾活血方对其影响
目的 基于构建Bcl2沉默和过表达腺病毒观察Bcl2对成骨细胞骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)蛋白的调节作用及补肾健脾活血方对其影响.方法 将培养的UMR-106细胞分为空载腺病毒组(沉默Bcl2空载腺病毒NC-bcl2,过表达Bcl2空载腺病毒WT-bcl2)、Bcl2腺病毒组(沉默Bcl2腺病毒sh-bcl2,过表达Bcl2腺病毒Ad-bcl2),空载腺病毒+空白血清组(NC-bcl2,WT-bcl2)、空载腺病毒+补肾健脾活血方含药血清组(NC-bcl2+ME,WT-bcl2+ ME)、腺病毒+空白血清组(sh-bcl2,Ad-bcl2)、腺病毒+补肾健脾活血方血清组(sh-bcl2+ ME,Ad-bcl2+ ME),用RT-qPCR检测Bcl2、OPG mRNA的变化、应用免疫印迹(Western Blot)检测Bcl2、OPG、BMP-2的变化.结果 ①荧光倒置显微镜观察包装腺病毒转染UMR-106细胞;②在正常培养基中,与NC-bcl2比较,sh-bcl2可以降低Bcl2、OPG、BMP-2蛋白的表达(P均＜0.05),与WT-bcl2比较,Ad-bcl2可以提高Bcl2、OPG、BMP-2蛋白的表达(P均＜0.05);③与NC-bcl2比较,RT-qPCR显示sh-bcl2可以降低Bcl2 mRNA的表达,但OPG mRNA无统计学意义;④在大鼠血清干预中,与空载腺病毒比较,补肾健脾活血方含药血清均可以增加BMP-2、OPG蛋白表达(P均＜0.05);在sh-bcl2干预的细胞中,补肾健脾活血方含药血清提高BMP-2、OPG蛋白的表达(P均＜0.05);在Ad-bcl2干预的细胞中,中药干预后,BMP-2、OPG未见明显变化.结论 Bcl2可以影响BMP-2、OPG蛋白的表达,补肾健脾活血方可能通过作用于Bcl2影响成骨细胞成骨相关蛋白的表达.
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低强度超声联合5-氨基酮戊酸对大鼠骨肉瘤UMR-106细胞的杀伤机制研究
目的：研究低强度超声结合5-氨基酮戊酸（5-ALA）对大鼠骨肉瘤UMR-106细胞的杀伤机制。方法将处于对数生长期的大鼠骨肉瘤UMR-106细胞分成对照组、5-ALA组、超声组和超声＋5-氨基酮戊酸组（SDT组）。流式细胞仪检测细胞凋亡率，活性氧（ROS）的产生，线粒体膜电位（MMP）的改变；荧光显微镜观察33342染色细胞核的形态改变；透射电镜观察超微结构改变。结果当超声频率为1．0MHz，声强2．0W/cm2，5-ALA浓度2mmol/L，SDT组与对照组、超声组及5-ALA组比较，其凋亡率（32．2±1．4）％，明显增高（P＜0．05）。同时伴有ROS（34．4±2．4）％的产生和MMP（42．2±2．6）％的降低。通过33342染色荧光显微镜观察到超声联合5-ALA组的细胞核发生浓缩和碎裂。透射电镜观察到细胞膜、线粒体、高尔基体等细胞器改变及凋亡小体的形成。结论低强度超声联合5-ALA对UMR-106细胞的杀伤作用明显，细胞以凋亡为主，其线粒体途径对UMR-106细胞凋亡起着重要作用。
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逍遥丸含药血清依赖雌激素受体促进鼠成骨细胞增殖作用的研究
目的:采用中药血清药理学的方法,制备逍遥丸含药血清(XCS),体外培养鼠成骨细胞株UMR-106,观察XCS对成骨细胞增殖影响及其是否与雌激素受体相关,以便为开展更广泛的临床实验提供理论基础.方法:选择Wistar大鼠30只,以2.7g/(kg·d)剂量灌胃逍遥丸,连续3周,第22日取动物血离心,将XCS冻存备用;体外培养UMR-106细胞,将细胞分为空白组、空白血清组、妊马雌酮(conjugated estrogens)含药血清组、XCS(20％,10％,5％,2.5％,1.25％,0.625％)不同浓度组,MTT法检测细胞增殖率,同时观察雌激素受体拮抗剂(ICI 182780)与细胞共孵育后细胞增殖能力.结果:与空白血清组相比,妊马雌酮含药血清和XCS(20％,10％,5％,2.5％)对UMR-106细胞的增殖有明显促进作用(P＜0.05),大增殖率达到(10.67±2.34)％;但在ICI 182780干预下,妊马雌酮含药血清和各浓度XCS对细胞增殖率无明显影响.结论:XCS对UMR-106细胞的增殖有明显促进作用,此作用需依赖雌激素受体才能发挥.
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氟化钠对大鼠成骨肉瘤细胞UMR-106成骨活性标志物的影响
目的 研究氟化钠(NaF)对大鼠成骨肉瘤细胞UMR-106成骨活性标志物的影响.方法 体外培养的UMR-106细胞,分别以0,500,1 000,2 000 μmol/L NaF处理24h、48h、72h.应用实时荧光定量PCR法检测各组碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)mRNA的表达;采用磷酸苯二钠法及蛋白免疫印迹法检测各组ALP活性和Col Ⅰ、Runx2蛋白表达.结果 NaF处理UMR-106细胞24h后,各浓度NaF均能刺激BGP基因表达;与对照组比较,NaF浓度高于1 000 μmol/L时,ALP、Runx2、BMP-2基因表达减弱;NaF处理72h后,500μmol/L组ALP、Runx2、BGP基因表达上调;NaF处理48h、72h后,当NaF浓度高于1000μmol/L时,ALP、Runx2、BMP-2表达及Ⅰ型胶原的合成随着NaF浓度的增高,抑制作用逐渐增强.UMR-106细胞及细胞培养液中ALP活性在24h 2 000μ mol/L组及48h,72h 1 000μmol/L组明显升高,随着NaF浓度的升高,UMR-106细胞Col Ⅰ蛋白的表达呈下降趋势.Runx2蛋白在2 000μmol/L组降低,差异有统计学意义.结论 氟化钠对成骨肉瘤UMR-106细胞成骨活性具有双向作用,与氟化钠剂量及细胞因子间联合作用有关.
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氟化钠对成骨细胞内Gs/Gi-AC-PKA信号途径的影响
目的 探讨氟化钠(NaF)对大鼠成骨骨肉瘤UMR-106细胞及小鼠MC3T3-E1成骨细胞内Gs/Gi-AC-PKA信号途径的影响.方法 以不同剂量NaF染毒UMR-106和MC3T3-E1细胞,培养24 h,用CCK-8法测定细胞增殖活性;用qPCR和Western Blot分别测定刺激性G蛋白(Stimulating adenylate cyclase g protein,Gs)、抑制性G蛋白(inhibitory adenylate cyclase g protein,Gi)、腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)和蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)的mRNA和蛋白的表达水平.结果 UMR-106细胞和MC3T3-E1细胞NaF染毒后的存活率随NaF浓度增加而降低(P＜0.05);不同剂量组之间,UMR-106细胞和MC3T3-E1细胞Gs、Gi mRNA的表达差异有统计学意义(P＜0.05),且随着染毒剂量的升高呈先升高后下降趋势;AC mRNA表达及蛋白表达差异均有统计学意义(P＜0.05),且呈明显下调趋势;UMR-106细胞和MC3T3-E1细胞的PKA mRNA和蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05),且随着染毒剂量的增加而呈明显上升趋势.结论 Gs/Gi-AC-PKA信号途径在氟骨症的形成过程中可能发挥一定作用.
