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滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析
目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoAreductase,HMGR)基因的cDNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析.方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因cDNA全长.构建pEASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达.利用生物信息学方法分析克隆到的cDNA序列并预测结构和功能.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况.结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR cDNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR cDNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2.SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白.Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系为相近.结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上.HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量高的是叶.结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础.
关键词： 滇龙胆 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 基因克隆 原核表达 生物信息学分析 -
一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析
目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析.方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因；利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平.结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmHMGR2分别具有75.04％,80.64％的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到高值.结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点.
关键词： 丹参 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 qRT-PCR -
珍稀濒危药用铁皮石斛HMGR基因的克隆和特征分析
3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶,在植物细胞萜类物质合成代谢过程中发挥重要作用.但是,HMGR基因在珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛类萜生物合成途径中的作用尚不清楚.本研究利用RT-PCR和RACE技术,首次从铁皮石斛中克隆到一个HMGR基因,命名为DoHMGRl (GenBank注册号JX272632).DoHMGR1基因cDNA全长2 071bp,编码一条由562个氨基酸组成的多肽,分子量59.73kD,等电点6.18.DoHMGR1蛋白包含HMGR蛋白家族的4个保守结构域(63～561、147～551、268～383、124～541)和两个跨膜基序(42～64、85～107).DoHMGR1基因与多种植物HMGR基因相似性很高(67％～89％),与万代兰、水稻、玉米等单子叶植物亲缘关系较近.DoHMGR1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛根和茎中表达量较高,为叶中的2.13和1.98倍.DoHMGR1基因的分子鉴定为进一步解析该基因在铁皮石斛萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用奠定基础.
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核黄素对高脂血症大鼠脂质代谢的影响
目的 研究核黄素(Riboflavin)对高脂血症大鼠脂质代谢的影响,并探讨其机制.方法 70只SD雄性大鼠随机分为两组,10只大鼠作为正常对照组,60只大鼠给高脂饲料建立高脂血症模型,剔除造模失败的大鼠,终造模成功高脂血症大鼠40只,分为模型对照组(HF)和低、中、高剂量组(分别为HF+LR、HF+MR、HF+HR组,核黄素剂量分别为0.667、3.385和6.670 mg/kg),每组10只.空白对照组正常饮食,其他组高脂饮食.实验末期(第60天)眼内眦采血(禁食)测卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT);取肝组织HE染色观察肝组织病理学形态,并制作10％肝匀浆测肝组织中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、胆固醇和甘油三酯水平.结果 HF+LR组肝脏胆固醇水平[(1.07±0.14)mmol/L]与HF组[(1.37±0.36)mmol/L]差异有统计学意义(P＜0.05);HF+LR组、HF+MR组肝脏甘油三酯水平[(1.73±0.28)、(1.82±0.38)mmol/L]明显低于HF组[(2.15±0.43) mmol/L],差异有统计学意义(P＜0.05);HF+LR组肝脏HMGR水平[(1.82±0.72)ng/ml]明显低于HF组[(2.88±0.99) ng/ml],差异有统计学意义(P＜0.05);核黄素干预组和HF组间血清LCAT水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 核黄素可能通过降低HMGR的水平来调节肝脂水平,从而影响脂质代谢.
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海马认知障碍对血脂水平的影响及其与肝脏HMG－CR表达的关系
目的：探讨海马认知障碍对血脂水平的影响及其与肝脏3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶 A还原酶（ HMG－CR）表达的关系。方法采用Aβ1～42大鼠海马内注射构建认知障碍模型，全自动生化分析仪检测血脂水平，半定量反转录－聚合酶链反应法（ RT－PCR）检测肝脏 HMG－CR mRNA的表达，蛋白印迹法检测肝脏HMGC－R 的表达。结果①实验组大鼠甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）分别为（2．30±0．08）mmol／L、（4．60±0．10）mmol／L、（2．41±0．06）mmol／L，与假手术组和对照组相比均显著升高（P＜0．05）。②实验组大鼠肝脏 HMG－CR mRNA表达水平为0．49±0．03，明显高于假手术组和对照组（P＜0．05）。③实验组大鼠肝脏HMG－CR表达水平为0．50±0．02，显著高于假手术组与对照组（P＜0．05）。结论海马认知障碍可引起大鼠血脂水平升高，其机制可能与认知障碍大鼠肝脏HMG－CR表达水平升高有关。
关键词： 认知功能障碍 脂代谢 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 -
计算机模拟筛选泽泻降血脂作用的化学成分
目的 运用计算机模拟方法筛选泽泻降血脂作用的化学成分.方法 采用Accelrys 公司Discovery Studio 2.0(DS 2.0)软件模拟,通过ligandfit模块进行分子对接,研究已知的36种泽泻三萜类成分的三维结构与3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶受体的相互作用,并在此基础上预测泽泻三萜类成分对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的作用.结果 以3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶为靶点,以原配体辛伐他汀与它模拟作用的DOCKSCORE值为阈值,筛选出与其结合较好的成分8个.结论 计算机模拟表明泽泻三萜类成分可能具有抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的作用,达到降血脂的作用.
关键词： 计算机模拟 泽泻 有效成分 降血脂作用 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 -
mfat-1小鼠胆固醇代谢特点及相关机制
目的 探讨mfat-1小鼠高脂饮食后血清胆固醇水平、胆固醇合成与吸收效率的改变及相关机制.方法 mfat-1小鼠及C57BL/6小鼠各12只分别作为实验组和对照组,高脂饲料喂养4周后,心脏取血并取肝脏组织,气相色谱法检测小鼠肝脏膜脂质内二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)、α-亚麻酸(ALA)、亚油酸(LA)、花生四烯酸(AA)的含量及血浆中总胆固醇、胆固醇合成标志物(角鲨烯、2,4-脱氢胆甾烷醇)及吸收标志物(菜油固醇、β-谷固醇、豆固醇)水平的变化,ELISA法检测两组小鼠肝脏中胆固醇合成限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-COAR)的表达水平.结果 实验组小鼠肝脏膜脂质内ω-6/ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)比例显著低于对照组(1.70比6.04,P＜0.01),血浆中胆固醇合成标志物角鲨烯、2,4-脱氢胆甾烷醇水平明显低于对照组(分别为0.63±0.17比1.24±0.36,3.89±0.54比6.57±1.06,P＜0.05),胆固醇合成限速酶HMG-COAR的表达较对照组显著降低(379.76±22.37比443.98±27.99,P＜0.01);胆固醇吸收标志物菜油固醇、β-谷固醇和豆固醇水平也显著低于对照组(分别为16.10±2.28比21.24±2.96、1.07±0.18比1.76±0.43、28.78±5.60比42.30±5.81,P＜0.01);总胆固醇水平较对照组降低(0.91±0.07比1.16±0.85,P＜0.01).结论 mfat-1小鼠通过抑制胆固醇的合成及吸收两种途径降低体内总胆固醇水平.
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炎症促进CCl4诱导的小鼠肝细胞脂质集聚与SREBP-1-HMGCR通路活化有关
目的:探讨炎症促进四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)所致的小鼠单纯性脂肪变性进一步脂肪集聚的分子机制.方法:12只6～8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组(n=6)和炎症组(n=6).2组均CCl4皮下注射2周后,再分别给予皮下注射生理盐水或酪蛋白16周,18周后处死小鼠,收集血清及肝组织标本,称量小鼠体质量及肝质量计算肝指数评估肝脏受损情况,ELISA法检测血清炎症因子白介素-6 (interleukin-6,IL-6),使用化学酶促比色法检测小鼠肝组织的脂质水平,油红O染色观察小鼠肝组织的脂质集聚情况,real-time PCR检测小鼠固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding proteins-1,SREBP-1)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,HMGCR)的基因表达水平,Western blot检测SREBP-1和HMGCR的蛋白表达水平.结果:炎症组IL-6的表达比对照组明显升高(t=8.434,P=0.000).与对照组相比,炎症组的SREBP-1和HMGCR基因的表达明显上调(t=10.612,P=0.000;t=12.749,P=0.000),Western blot显示SREBP-1和HMGCR的蛋白表达趋势与基因一致.肝脏脂质检测显示炎症组比对照组的肝脏脂质明显升高(t=6.148,P=0.000;t=7.288,P=0.000).肝指数提示与对照组相比,炎症组的肝指数明显升高(t=8.452,P=0.000),油红O染色显示炎症组的脂质集聚明显高于对照组.结论:炎症因子可能通过促进SREBP-1-HMGCR表达使CCl4所致的小鼠脂肪变性肝细胞胆固醇内源性合成增加,加重肝脏脂质的异常集聚.
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辛伐他汀抑制肺动脉高压大鼠肺动脉内COX-2的表达
目的:探讨3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-COA)抑制剂辛伐他汀对肺动脉高压(PAH)大鼠环氧合酶(COX-2)的影响.方法:雄性SD大鼠30只,随机分为正常对照组、PAH模型组和辛伐他汀干预组,每组10只.用PM-8000型多参数监护仪及Elastin Van Gieson染色法,分别测定各组大鼠的平均肺动脉压力及肺小动脉新生内膜增殖度和平均血管阻塞计分(VOS)的改变.用免疫组化染色法和荧光定量PCR法,测定肺组织中的COX-2在蛋白和基因的水平上表达的差异.结果:PAH模型组大鼠的平均肺动脉压力、肺小动脉新生内膜增殖度和VOS的改变,均较正常对照组显著增加(P＜0.05),其COX-2在蛋白和基因的水平上的表达都明显高于正常对照组(P＜0.05).辛伐他汀干预后,大鼠的平均肺动脉压力、肺小动脉新生内膜增殖度和VOS,均较PAH模型组显著减少(P＜0.05),COX-2在蛋白和基因的水平上的表达都明显低于PAH模型组(P＜0.05).结论:辛伐他汀可抑制肺动脉内COX-2的表达来抑制PAH形成.
