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乙型肝炎病毒"a"决定簇突变对乙型肝炎疫苗保护效果的影响
目的 研究乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)"a"决定簇热点突变对乙肝疫苗保护效果的影响.方法 根据HBV基因保守序列设计PCR扩增引物,针对"a"决定簇突变设计简并探针,制备检测HBV"a"决定簇16种热点突变的基因芯片,并用克隆测序对芯片检测结果进行验证.基因芯片法检测47对乙肝疫苗阻断失败的母婴配对样本和323例阻断成功的母亲样本.结果 克隆测序证明,基因芯片法具有特异性.应用该法检测发现,野生株(阳性率为78.66%)仍为主要流行株,依次为126A(11.27%)、145R(5.76%)、126S-1(5.28%)、126S-2(4.56%)、129H(1.20%)、144A(0.72%)、129R(0.24%),但126A阳性率显著高于其他突变(P值均＜0.01).阻断失败组母婴均感染的样本与阻断成功组的126A、126S-1、126S-2和145R检出率的差异无统计学意义.结论 现有乙肝疫苗可阻断126A、126S和145R突变株的母婴传播,目前毋需研制针对126和145位点突变的新型乙肝疫苗,但需加强对突变株的流行病学监测.
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乙肝病毒"a"决定簇129Leu变异株免疫原性低下的机理及临床意义
目的研究乙肝病毒"a"决定簇129Leu变异株免疫原性低下的机理及其临床意义. 方法用野毒株质粒DNA(p3.8Ⅱ)及用p3.8Ⅱ组建的129Leu、129His、145Arg(分别称为p3.8Ⅱ 129L、p3.8Ⅱ 129H 、p3.8Ⅱ 145R)重组质粒DNA转染HepG2细胞,检测转染细胞上清HBsAg、HBeAg水平及胞内HBV复制情况.以重组质粒DNA免疫BALB/c及C57BL/6鼠,比较各重组质粒DNA免疫鼠后诱生的抗体水平及脾细胞特异性IFN-γ水平.对各重组质粒DNA表达S基因"a"决定簇作亲/疏水性分析.在134例HBsAg阳性慢性乙肝患者中用PCR-SSCP筛选后测序方法,寻找"a"决定簇变异株. 结果p3.8Ⅱ 129L重组质粒免疫鼠血清的抗-HBs效价与脾细胞诱生的IFN-γ在2种品系鼠中均低于野毒型或p3.8Ⅱ 129H免疫鼠(P＜0.05).在134名HBsAg阳性的慢性乙肝患者血清中,仅有9/134(6.9%)出现"a"决定簇氨基酸变异,但其中1例为129Leu变异. 结论 129Leu变异株的T、B细胞免疫原性低下主要是由于该氨基酸变为亮氨酸所致,可能与该位点变为亮氨酸后疏水性增高有关.该变异株检出率虽然不高,但确实存在于慢性乙肝患者中.
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乙型肝炎病毒大S蛋白基因纵向研究方法及应用
目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)大S蛋白基因纵向研究方法,并将其应用于疾病进程中HBV的准种动态研究.方法:以2例HBV感染者(对象A,男,38岁;对象B,女,22岁.对象A研究期间未经任何抗病毒治疗,B则1年持续接受ADV抗病毒药物治疗)体内不同时期的血清样本核酸提取物为模板,通过特异性扩增获取病毒大S蛋白基因序列并克隆测序,依据生物信息学方法对发生于序列结构不同区域的变异进行分析,利用比对数据对不同样本HBV准种予以描述与评价.结果:所得24条HBV大S蛋白基因序列中2条源于对象B样本的基因序列PreS2编码区存在30 nt的缺失,其余22条序列大小均为1203bp;24条序列的HBV基因型均为c型.对象A大S蛋白基因序列分散值DA、DB、Dc分别为:0.29、0.16、0.23,对象B则为0.80、2.30、1.82.来自对象A的全部10条HBV大S蛋白基因序列内部的"a"决定簇与参考基因完全一致;对象B的14条序列期初有2条(29%)期终有6条(86%)存在G145R突变,期终序列中有1条序列"a"决定簇内发现4个位点的突变.结论:人体内感染HBV以准种形式存在且可以用分散值DA、DB、Dc对其进行描述,并应用于HBV准种动态的纵向研究.而抗病毒药物ADV的1年期治疗可使本例HBV准种分散性增高,可能增加本例耐药性突变出现的风险,同时增加本例"a"决定簇的变异出现.
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表面抗原和抗体双阳性乙型肝炎患者HBV S基因"a"决定簇序列分析
目的 分析HBsAg和抗-HBs双阳性乙型肝炎患者HBV S基因"a"决定簇序列特征.方法 巢式PCR法扩增4例HBsAg和抗-HBs双阳性乙型肝炎患者HBV S基因,PCR扩增产物直接进行测序和克隆后测序,对获得的"a"决定簇序列进行比对分析.结果 PCR扩增产物直接测序表明,4例患者HBV"a"决定簇低保守区各有1个氨基酸位点显示多态性.PCR产物克隆后测序表明,病例1 S基因"a"决定簇126位点(s126)氨基酸可为苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)和丝氨酸(S),s134氨基酸可为苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S);病例2 s126氨基酸可为丙氨酸(A)和苏氨酸(T);病例3 s126氨基酸可为异亮氨酸(I)和天冬酰胺(N);病例4未发现多态性位点.结论 HBV S基因"a"决定簇序列的多态性可能是引起乙型肝炎患者HBsAg和抗-HBs双阳性的原因之一.
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HBV "a"决定簇突变及其对宫内传播影响的研究
目的探讨孕妇乙型肝炎病毒感染者"a"决定簇突变及其对HBV宫内传播的影响. 方法收集2001年11月至2004年7月在太原市传染病医院妇产科住院的HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血,选取其中部分HBV DNA阳性标本进行nPCR产物直接测序,分析HBV "a"决定簇变异情况,比较HBV "a"决定簇突变组孕妇与未突变组孕妇HBV宫内感染率的差别. 结果 307例血清HBsAg阳性孕妇中,HBeAg阳性119例,HBV DNA阳性126例.309例新生儿中,HBsAg、HBV DNA任一项阳性者69例,新生儿HBV宫内感染率为22.33%(69/309).经过测序的49份标本(41份孕妇标本、8份婴儿标本)中,HBV基因型以C型、B型为主,D型只发现1份.49份标本(含1份假阳性)中共有7份标本(6份孕妇标本、1份婴儿标本) (9个位点)发生了HBV "a"决定簇突变,突变检出率为14.58%(7/48);突变组和未突变组的HBV宫内感染率分别为50.00%(3/6)、40.00%(14/35),差异无统计学意义(χc2=0.000 120, P>0.05);发生了HBV宫内感染的母儿之间,HBV序列同源性在98.67%以上,其中1例新生儿所携带HBV的aa145的密码子发生了同义突变(GGA→GGC). 结论对于感染HBV的孕妇而言,无论携带HBV "a"决定簇变异株还是野生株,未发现其新生儿发生HBV宫内感染的可能性有差别;宫内传播过程中存在S基因"a"决定簇变异株.
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检测乙型肝炎病毒"a"决定簇热点突变基因芯片的制备和初步应用
目的 为快速、高通量检测HBV"a"决定簇热点突变,制备基因芯片,并进行了初步应用.方法 应用HBV基因保守序列设计PCR扩增引物,针对"a"决定簇突变设计简并探针,制备了检测126A、126S、144A、145R、145E、144A+145R和144A+145E突变的基因芯片.通过对质粒参考品或样本进行测定,以评价芯片的特异性、灵敏度、重复性和检测劣势株的能力,并对45例乙型肝炎患者的血清样本同时应用基因芯片和PCR产物直接测序法进行检测比较.结果 所制备的基因芯片能特异性检测出质粒参考品,灵敏度为5×103拷贝/μl.同一样本检测10次,芯片内和芯片间变异系数均小于15%.当劣势株占HBV毒株10%以上时,基因芯片即可检出.芯片法测得45例样本中126A、126S-1和126S-2的阳性率(分别为46.67%、35.56%和24.44%)显著高于PCR产物直接测序法(分别为9.00%、4.44%和2.22%;P直分别为0.000、0.000和0.002),克隆测序验证了基因芯片法的特异性.结论 基因芯片法可快速、有效地检测HBV特定位点突变株,为HBV突变的大规模筛查提供了方法.
