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利用实时荧光定量PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数
为分析转基因水稻外源基因拷贝数,利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法进行转基因水稻外源基因拷贝数的分析.转基因外源基因的拷贝数通过转基因水稻外源基因(GUS和HPT基因)和水稻内标准SPS基因含量的比较计算获得.定量分析了14株T0代的转基因水稻植株,得到了外源基因插入分别为1、2、3和4的转基因植株,同时利用Southern Blot方法进行验证分析.随机选择18个已经过定量PCR检测分析的转基因水稻植株,用Southem Blot的方法分析转基因水稻植株中的HPT或GUS基因的拷贝数,Southem Blot分析结果显示有15个转基因水稻植株的分析结果与定量PCR分析的结果是一致的,3个植株定量PCR分析的转基因拷贝数稍高于Southem Blot的分析结果,主要原因是Southern B10t方法在同一个插入位点有多拷贝的T-DNA片段插入时,转基因植株的基因组在完全酶切时会产生相似的DNA片段,电泳分析时很难分辨清楚.定量PCR方法则完全避免了这种情况的发生,除非目的基因DNA片段在PCR引物处发生断裂.两种方法分析结果的比较显示定量PCR方法分析转基因拷贝数更加有效、适用.
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6例有Pierre Robin序列征表型的新生儿全基因组拷贝数变异分析
目的 应用全基因组微阵列芯片平台,对6例具有Pierre Robin序列征(Pierre Robin sequence,PRS)表型的新生儿进行全基因组拷贝数变异(copy number variations,CNVs)检测,以发现与PRS相关的准确定位. 方法 对2009年6月至2010年5月复旦大学附属儿科医院新生儿病房收治的符合PRS表现的6例患儿进行研究.采用Cytogenetic Whole Genome芯片筛查全基因组CNVs,对发现的所有CNVs进行分析,参照国际基因组拷贝数变异多态性数据库除外正常人群多态性CNVs.结合已知PRS的相关区段进行分析,并与已发表文献进行比较. 结果 (1)6例患儿均具小下颌畸形、腭裂及舌后坠3种表型.此外,2例有其他特殊面容表现,2例有先天性心脏病,1例有先天性喉软骨发育不良,1例存在脉络膜多发囊性占位.(2)6例PRS患儿经微阵列芯片检测,终获得7个罕见、有潜在临床意义的CNVs,分别为位于lp36.23-p26.22、l4q11.l-q11.2和20p13的重复,以及4q23、1 q43-q44的缺失各1例和l4q32.31的缺失2例.(3)文献比对分析显示,1q43-q44、14q32.31区段可能与PRS表型有关,1q43-q44区段包含与神经系统发育相关的基因AK T3和不均-核蛋白U(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U,hnRNPU)；14q32区段编码核仁小分子RNA,可能为基因组印迹区. 结论 本研究提供了应用全基因组微阵列平台分析罕见、有潜在致病可能的CNVs方法,提示1q43-q44和14q32.31可能为与PRS有关的染色体区段.
关键词： Pierre Robin综合征 基因剂量 变异(遗传学) 基因组 微阵列分析 -
比较基因组杂交技术及其在医学遗传学中的应用
比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)是1992年Kallioniemi创立的基于荧光标记和分子、细胞遗传学技术鉴定基因组DNA的获得、丢失和扩增,并且可以把这些遗传变异定位在正常的中期染色体上的一种技术[1],也称之为中期CGH (metaphase- CGH).主要特点是在一个实验中,用1张中期染色体涂片(metaphage spreads),就能在全基因组范围内分析大的DNA 拷贝数的不平衡改变,检测和定位DNA序列拷贝数的获得和丢失,即基因剂量的变化而不需要分裂的细胞.在其创立初期主要应用于肿瘤基因组学的研究.
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pUDKH基因治疗制剂临床前安全性初步分析
目的:观察大鼠肌肉注射pUDKH后,出现毒性反应的时间、性质和程度,为临床毒副反应的监测和确定初始安全剂量提供依据.方法:实验设3个组,即正常对照组、pUDKH小剂量(0.63 mg/kg)和大剂量(2.50 mg/kg)组,给药途径为肌肉注射,且每只大鼠的给药方式相同,每只大鼠共给药14次,停药后观察16周.试验期间观测一般药物反应,分析尿液生化和血清生化,测定大鼠血清中抗人肝细胞生长因子(HGF)的抗体,目的基因HGF在多种组织内的分布,病理组织学检查各脏器的组织结构.结果:试验中给药组动物未见药物毒性反应,尿生化指标基本无有意义的变化,各时间点血清生化也无明显有意义的改变.各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体.除了注射局部的肌肉组织检测到高表达的HGF外,其他组织未见到高表达的HGF.各脏器病理学检查均未见异常改变.结论:大鼠肌注pUDKH剂量为0.63 mg/kg和2.5 mg/kg两种,分别是大鼠起始有效剂量的3倍和12.5倍,各项观测指标未见明显有意义的改变,故在本试验条件下可视2.50 mg/ kg以下为安全剂量,pUDKH基因治疗大鼠肢体缺血是安全、可行的.
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操纵子重复克隆以提高外源基因的表达水平及同一大肠杆菌细胞内质粒DNA总量为一常数的新概念
目的确定在一个质粒载体上串联目的操纵子以提高目的蛋白表达量的可行性,阐明宿主细胞对胞内质粒DNA总量调控的可能机制.方法亚克隆构建了两组操纵子正向串联的表达质粒:CWll系列分别含1-4个正向操纵子,质粒大小以2.25 kb的增加量从5.47 kb增加至12.26 kb;CW12系列分别含1-3个正向操纵子,质粒大小以2.16 kb的增加量从5.40 kb增加至9.72 kb.SDS凝胶电泳和激光密度扫描测定目的蛋白表达量;3H-TdR掺入法测定质粒拷贝数.结果操纵子的串联不影响宿主大肠杆菌的生长;温度诱导表达后CW11系列目的蛋白表达量分别为菌体总蛋白的44.9%±3.9%、51.3%±4.1%、54.8%±3.3%和58.2%±3.4%,CW12系列目的蛋白表达量分别为菌体总蛋白的32.2%±5.0%、42.8%±4.1%和46.9%±4.0%.两组质粒的拷贝数均随操纵子串联个数的增加而显著减少(P<0.01),但目的基因的总剂量随之显著增加(P<0.01),而同一系列的质粒在每个宿主细胞内的质粒DNA总量没有显著的变化(P>0.05).结论操纵子串联增加了目的基因的剂量从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平.质粒大小和其拷贝数呈负相关,在同一培养条件下,对于特定的大肠杆菌菌株,同一系列的质粒在宿主细胞内的DNA总量在一定程度上相对恒定.
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N-乙酰化酶2基因型对中国肺结核患者异烟肼代谢的影响
目的 研究N-乙酰化酶2(NAT2)基因型对中国肺结核患者异烟肼(INH)代谢的影响.方法 采用反向点交法(RDB)检测中国肺结核患者NAT2基因型;柱前衍生化高效液相色谱法检测服药2 h后血浆中INH及其代谢物乙酰化INH(Ac-INH)浓度.结果 46例患者基因型包括野生型wt/wt(n=17)、杂合子m/wt(n=22)、突变型纯合子m/m(n=7).血浆INH及AcINH浓度分别为(12.74±10.51)和(12.49±9.61)μmlo·L-1 3个基因组玳H、AcINH浓度比为1:1.37:1.77和1:0.77:0.75;3组AclNH与INH比值(RA/I为1:0.52:0.40(P<0.01).结论 不同NAT2基因型的结核患者对INH代谢能力差异显著,存在基因剂量现象.NAT2基因分型对结核患者合理用药具有重要意义.
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抑郁症患者细胞色素P4502C19基因型对阿米替林血药浓度及其去甲基代谢的影响
目的探讨中国人的CYP2C19基因型对阿米替林血药浓度及其去甲基代谢的影响.方法采用多聚酶链式反应和限制性片段长度多态性分析测定59例汉族抑郁症患者CYP2C19的基因型.高效液相色谱紫外检测法测定阿米替林及去甲替林的稳态血浆浓度.结果59例患者检测出4种CYP2C19基因型:wt/wt型(n=4),wt/ml型(n=49),ml/ml型(n=4),ml/m2型(n=2).基因ml频率为0.5,基因m2频率为0.017.单位剂量阿米替林及去甲替林的稳态血药浓度有明显个体差异,分别相差31倍和26倍.CYP2C19不同基因型的单位剂量阿米替林浓度差异无显著性意义(P＞0.05);单位剂量去甲替林血浓度wt/ml型与ml/ml型相比[(0.64±0.44)μg·L-1·mg-1比(0.18±0.08)μg·L-1·mg-1)]有显著性差异(P＜0.05),其他分型之间比较无显著性差异(P＞0.05).阿米替林/去甲替林浓度比值大小依次为:wt/wt型1.05±0.28,wt/ml型1.45±0.81,ml/ml型4.59±1.44;wt/wt型和wt/ml型与ml/ml型相比均有极显著性差异(P＜0.01),wt/wt型与wt/ml型相比无显著性差异(P＞0.05).结论在中国汉族抑郁症患者中,CYP2C19介导的阿米替林去甲基代谢表现出基因剂量效应倾向,其中ml/ml型阿米替林代谢生成去甲替林明显减少.
