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脱细胞基质补片无张力疝修补术对腹股沟疝患者血清炎性因子及精液质量的影响
目的 探讨脱细胞基质补片无张力疝修补术对腹股沟疝患者血清炎性因子及精液质量的影响.方法 将2014年5月至2016年1月我院收治的110例腹股沟疝无张力疝修补术患者,采用随机数字表法分为观察组和对照组各55例,对照组采用聚丙烯补片材料,观察组采用脱细胞基质生物补片,比较两组手术相关指标、血清炎性因子、精液质量等.结果 两组手术时间、术中出血量、恢复日常生活时间等比较差异无统计学意义(P＞0.05);观察组并发症明显低于对照组(P＜0.05);术后4d,观察组血清白细胞(WBC)、白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)水平均低于对照组(P＜0.05);随访3个月,观察组精液量、精子密度、a+b级精子百分率均高于对照组(P＜ 0.05).结论 脱细胞基质补片无张力疝修补术有助于缓解腹股沟疝患者炎症反应,保护睾丸与输精管组织结构,减少术后并发症.
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人耳软骨移植抗原性及脱细胞处理对其的影响
目的研究人耳软骨的移植抗原性及脱细胞处理对其的影响. 方法用低渗的Triton X-100为主的方法脱去人耳软骨细胞,然后通过抗人主要组织相容性复合体-I(MHC-I)免疫组织化学染色,与单个核细胞共同培养来研究人耳软骨的移植抗原性及脱细胞处理对其的影响. 结果软骨细胞胞浆抗人MHC-I为阳性,抗原的分布以细胞核周边的细胞质为主.细胞外基质抗人MHC-I为阴性.而经过脱细胞处理后的人耳软骨则呈抗人MHC-I阴性.单个核细胞与软骨共同培养时则显示出较高DNA合成能力,与对照组比较有统计学意义(P＜0.05).单个核细胞与脱细胞处理的软骨共同培养后的DNA合成能力较低,与单纯的单个核细胞培养展示出新的DNA合成能力,但无显著差异(P＞0.05).单个核细胞与正常人耳软骨共同培养的过程中,可见移向软骨的单个核细胞随时间增加而增加.相反,单个核细胞与脱细胞处理的软骨共同培养后,却少见单个核细胞移向脱细胞处理的软骨(P＜0.01). 结论软骨具有移植抗原性;以低渗的Triton X-100为主的脱细胞方法可以有效的去除移植物的抗原性,从而避免同种异体组织移植排斥反应的发生.
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利用不同支架材料构建人工真皮的研究
目的探讨脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶的不同支架材料上构建人工真皮的可行性. 方法采用酶消化法分离幼儿包皮成纤维细胞,并进行传代培养;将第3代成纤维细胞种植于三种不同支架上,14天后利用HE染色、透射电镜和扫描电镜对构建的人工真皮结构进行鉴定.结果①酶消化法得到皮肤成纤维细胞,可在含有10%小牛血清的DMEM中传代培养;②成纤维细胞在三种不同支架上形成单层细胞,并可向胶原膜和胶原凝胶内部生长;③成纤维细胞在胶原膜和脱细胞基质内增殖不如胶原凝胶内活跃,但人工真皮收缩不明显,而胶原凝胶构建的人工真皮收缩明显. 结论利用脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶支架材料构建的人工真皮具有较好的组织结构,是一种较理想的皮肤替代物,可作为移植物进行深入研究.
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鹿茸软骨组织脱细胞基质材料的制备及生物相容性研究
目的 探讨鹿茸软骨制备脱细胞基质材料的可行性以及生物相容性,为软骨修复重建探索新材料.方法 取梅花鹿鹿茸生长中心间充质层,进行由DNA酶、RNA酶、抑肽酶等介导的脱细胞处理;行组织学和DNA含量检测,评价脱细胞效果.取第2代鹿生茸区骨膜(antlerogenic periosteum,AP)细胞,行荧光干细胞标记明确其干细胞特性后,用PKH26荧光标记并与制备的间充质层脱细胞基质进行复合培养;7d后取材行HE染色观察以及荧光显微镜下观察PKH26标记的AP细胞在基质表面生长情况.以上观测均以未复合AP细胞的脱细胞基质作为对照.将复合培养7d的样本移植至裸鼠一侧腹股沟(实验组),取空白培养样本移植于另一侧(对照组).于移植后7、21d取材行HE染色,同时对组织进行冰冻切片并在荧光显微镜下观察PKH26标记成功的AP细胞在脱细胞基质表面及内部的生长情况,评价含AP细胞的脱细胞基质在裸鼠体内的组织相容性.结果 HE和DAPI染色显示脱细胞处理后材料中无细胞残留,DNA含量为(19.367±5.254) ng/mg,较脱细胞处理前的(3 805.500±519.119) ng/mg显著降低(t=12.630,P=0.000),提示成功制备间充质层脱细胞基质.AP细胞与间充质层脱细胞基质复合培养7d后,AP细胞主要黏附于材料表面,部分进入脱细胞基质内部.植入裸鼠体内后,随观察时间延长,接种AP细胞可以在脱细胞基质材料中增殖并逐渐进入材料内部,并诱导血管生成.结论 实验成功制备鹿茸软骨脱细胞基质,该基质材料在离体和活体情况下适于种子细胞(AP细胞)的黏附和增殖,并具有刺激血管生成的功能,为其用于软骨组织修复提供理论依据.
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聚氨酯-脱细胞基质复合支架的制备及体内外生物相容性研究
目的 构建用于膀胱修复与重建的聚氨酯(polyurethane,PU)-膀胱脱细胞基质(bladder acellularmatrix,BACM)复合支架,并对其力学性能和生物相容性进行体内外评价.方法 取10只雄性新西兰大白兔膀胱,经1％SDS及1％Triton X-100脱细胞处理后,用PU乳液对所得BACM进行表面涂覆,获得PU-BACM复合支架;用力学试验仪测试BACM与PU-BACM支架的拉伸强度及断裂伸长率.将人膀胱平滑肌细胞(human bladdersmooth muscle cells,HBSMC)分别与BACM、PU、PU-BACM支架共培养,通过细胞计数试剂盒8法比较各组材料对细胞增殖的影响.以DMEM培养基制得上述3种材料浸提液,并以DMEM培养基作对照,与HBSMC共培养,流式细胞仪测定细胞周期.取12只雄性新西兰大白兔膀胱剪开5 mm小口,将PU-BACM支架以锁边法缝合于膀胱切口部位以建立膀胱损伤修复模型,术后10、20、40、60 d取材行HE染色观察炎性浸润、材料降解和上皮再生情况.结果 BACM和PU-BACM的拉伸强度分别为(5.78±0.85)N和(11.88±3.21)N,断裂伸长率分别为14.46％±3.21％和23.14％±1.32％,差异均有统计学意义(t=3.182,P=0.034;t=4.332,P=0.012).细胞增殖实验显示,体外培养5、7d后,PU-BACM支架组细胞增殖显著高于BACM组(P＜0.05);细胞周期实验中,对照组及PU、BACM、PU-BACM组的细胞增殖率分别为36.78％±1.21％、30.49％±0.89％、18.92％±0.84％和22.42％±1.55％,PU-BACM组显著高于BACM组(P＜0.05).兔膀胱修复实验中,术后10 d移植部位出现单核炎性细胞浸润情况;20d炎性反应逐渐减弱、材料逐步降解;40d观测到上皮再生;60d移植部位形成与正常组织类似结构,修复基本完成.结论 PU-BACM复合支架较BACM力学性能及生物相容性均有显著提升;在兔膀胱修复实验中,复合支架未导致强烈的免疫反应,并在移植部位形成新生膀胱组织,可为进一步研究提供基础数据.
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生物来源水凝胶在组织工程中的应用与进展
目的 综述各种生物来源水凝胶的特性及其在组织工程领域的应用与研究进展. 方法 查阅近年有关生物来源水凝胶的文献,并对其进行分析总结. 结果 生物来源水凝胶大体可分为单一成分(胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐及丝素蛋白等)水凝胶及多成分(基质胶、细胞外基质提取物、脱细胞基质)水凝胶两大类.它们大多来自生物组织的细胞外基质,因此具有良好的生物相容性及生物活性.其中,脱细胞基质水凝胶无论成分还是结构,均更加符合仿生学要求,是目前接近细胞生长天然环境的支架材料. 结论 生物来源水凝胶已广泛应用于组织工程研究,尽管现有水凝胶材料仍存在力学性能欠佳、降解速度过快以及血管化、灭菌方法、免疫原性等方面的问题,但随着优化机制的不断深入研究,有望获得理想的生物来源水凝胶材料,并真正应用于临床.
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脂肪脱细胞基质的制备和初步评价
目的 制备人脂肪脱细胞基质并初步评价其细胞相容性,为构建组织工程脂肪寻找理想的支架材料. 方法 以接受乳腺癌根治术或乳腺癌改良根治术患者自愿捐赠的腹壁皮下脂肪组织作为实验标本,取其中一部分经反复冻融、有机溶剂抽提以及酶消化处理制备脂肪脱细胞基质,大体观察其性状,行组织学、免疫组织化学、DAPI荧光染色及扫描电镜观察材料脱细胞效果、重要组成成分(Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白)保留情况及微观结构.取另一部分脂肪组织采用酶消化法分离培养人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),取第3代细胞分别与脂肪脱细胞基质及浓度为100％、75％、50％、25％的浸提液复合培养.采用MTT法检测细胞毒性,扫描电镜观察细胞黏附情况,活/死细胞染色评价细胞增殖情况. 结果 脂肪脱细胞基质基本保持原组织外形;无细胞残留且保留较完整细胞外基质成分,含丰富的Ⅰ型胶原,无DNA、脂质残留;其以胶原纤维为主,含丰富的层粘连蛋白和纤连蛋白.脂肪脱细胞基质不同浓度浸提液与细胞复合培养1、3、5d,细胞毒性均为0～1级.hADSCs在脂肪脱细胞基质中黏附、增殖良好. 结论 利用反复冻融、有机溶剂抽提以及酶处理法所制备的脂肪脱细胞基质保留了较完整的细胞外基质成分,细胞相容性好,有望成为组织工程脂肪支架材料.
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脱细胞基质在组织工程气管移植中的研究进展
目的 综述脱细胞基质在组织工程气管中的研究现状、进展及未来前景. 方法 广泛查阅脱细胞基质在组织工程气管研究中的相关文献,对不同脱细胞基质修复人和动物气管病损的研究现状进行综合分析. 结果 气管组织工程应用的脱细胞基质包括空肠、膀胱、主动脉和气管. 结论 脱细胞膀胱基质及空肠基质在修复气管小范围非环形病损中具有较好效果,脱细胞主动脉基质在长段气管病损中的应用还需进一步研究,脱细胞气管基质在长段气管病损中具有良好的应用前景.
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脱细胞基质在软骨组织工程中的应用
目的 综述脱细胞基质(acellular matrix,ACM)在软骨组织工程中的应用与研究进展. 方法 广泛查阅近年国内外相关文献,进行回顾与综合分析. 结果 许多研究者联合采用了渗透溶液法、冷冻干燥法和理化交联法等技术对软骨ACM支架进行了改进.软骨ACM支架用于构建组织工程软骨的实验结果 与ACM的特性密切相关. 结论 ACM在软骨组织工程领域有着广泛的应用前景,其特性的改进与完善非常重要.
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猪主动脉脱细胞基质的简化制备及生物学评价
目的 应用酶法制备猪主动脉脱细胞基质,并评价其生物学性能. 方法 取新鲜屠宰的16根肉猪降主动脉,长10～12 cm,应用0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA于37℃震荡条件下脱除细胞成分,HE和Masson染色行脱细胞基质的组织学观察,扫描电镜和透射电镜观察超微结构改变.应用单轴拉伸方法比较脱细胞前和脱细胞后48、96和120 h时材料两断端厚度、极限抗张强度(ultimate tension stress,UTS)和断裂伸长率(strain of failure,SOF),绘制应力-应变曲线.取成年杂种犬3只,体重20～30 kg,雌雄不限.将脱细胞前后片状主动脉基质埋植于犬脊柱两侧皮下,分别于埋植后1、3和6周取材,行HE染色观察,参照半定量的Wakitani评分法,对取材时的大体形态、浸润细胞种类和数量、新生血管等指标进行比较,观察宿主炎性细胞反应和脱细胞基质变化.将犬内皮细胞种植于猪脱细胞基质,HE染色和扫描电镜观察细胞相容性. 结果 HE染色和电镜检查显示在96h可将新鲜猪主动脉细胞成分脱除,Masson染色显示细胞外纤维成分保留完整.脱细胞前后的动脉基质厚度、UTS和SOF差异均无统计学意义(P＞0.05),但UTS显示降低趋势,SOF则呈现增加趋势,应力-应变曲线呈现力学强度降低和延展性增加的变化趋势.犬皮下埋植,各组脱细胞标本炎性细胞浸润明显减轻,6周时以成纤维细胞浸润为主,且基质中见新生毛细血管.半定量组织学评分,在大体观察、浸润细胞种类和数量方面与脱细胞前比较有统计学意义(P＜0.05);新生血管数量比较,差异无统计学意义(P＞0.05).HE染色和扫描电镜显示种植的内皮细胞可在基质表面形成单细胞层. 结论 应用0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA持续振荡96 h制备的猪主动脉脱细胞基质,在生物力学、免疫原性和细胞相容性方面可满足血管组织工程的需要.
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脱细胞基质在血管组织工程中的应用
组织工程学的产生和发展为终解决人类器官或组织缺损这一世界性难题提供了可能.组织工程的核心思想就是运用个性化的设计方案在体外构建具有生命力的活体并植人体内,从而达到修复缺损、重建功能、提高生活质量和延长生命之目的.胸心血管外科领域集中了心脏、血管、食管、气管等诸多重要器官和组织,开展组织工程研究具有重要的实验和临床价值.
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猪胆道缺损修补实验动物模型的建立
目的 建立猪胆管缺损修补模型,比较脱细胞基质修复胆管缺损与胆肠吻合术的优缺点.方法 建立猪胆管缺损模型,并使用脱细胞基质进行修补,对修补组与常规胆肠吻合组进行比较.结果 成功建立猪胆道缺损修补实验动物模型,成功率为91％.在手术时间及中位生存期方面,修补组与常规手术组相比(P＜0.05),修补组明显优于常规手术组.结论 较短的手术时间,较低的手术后并发症,较长的存活时间均提示脱细胞真皮基质修复胆道效果良好.
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猪主动脉瓣去细胞基质的制备
目的 完全去除猪主动脉瓣细胞,取得良好的去细胞支架材料.方法 用5g/L胰酶刘标本中的某些基质和细胞加以消化后,再应用不同去垢剂(十二烷基硫酸钠、脱氧胆脂酸钠、Triton X-100)加以洗脱,结合溶液渗透压改变等去除猪主动脉瓣细胞;标本进行大体、光镜、电镜观察和热皱缩温度的检测.结果 胆脂酸钠无法完全脱除猪主动脉瓣细胞,十二烷基硫酸钠和曲拉通均可完全去除猪主动脉瓣细胞,Triton X-100组的主动脉瓣胶原纤维和弹性纤维得以较好保持.结论 Triton X-100可以成功脱除猪主动脉瓣细胞,为组织工程瓣膜的研究提供材料.
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不同试剂脱除猪胸主动脉壁细胞的对比研究
目的:用不同方法去除猪胸主动脉壁细胞,并比较去细胞效果,为组织工程瓣膜或带瓣管道提供良好的实验材料.方法:采用十二烷基硫酸钠、胆脂酸钠、曲拉通(TritonX-100)制备猪胸主动脉脱细胞基质.将实验分为十二烷基硫酸钠组、胆脂酸钠、曲拉通组和空白对照组.标本进行大体、光镜、电镜观察,力学性能的检测并做比较.结果:胆脂酸钠无法完全脱除主动脉壁内细胞,十二烷基硫酸钠和曲拉通都能完全脱除猪胸主动脉细胞,曲拉通较好地保持了胶原纤维和弹性纤维的原有排列和分布,并有较好的力学性能.后两者脱细胞时间无显著差别.结论:曲拉通可以成功用于制备大血管脱细胞基质,为组织工程瓣膜或带瓣管道的研究提供材料.
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角膜基质脱细胞处理与相容性实验研究
目的 寻找有效适宜的脱细胞方法对猪角膜进行处理,制备角膜生物支架材料.方法 利用胰酶和胶原酶消化结合液氮冻融的方法对猪角膜基质进行处理,60Co消毒,冻干保存.经组织学观察、细胞培养附和与动物移植检验其生物特性.结果 获得的脱细胞角膜基质,显微结构观察显示板层结构完整,胶原纤维间组织结构疏松,未见细胞残留,整个基质成网状结构,在上皮面保存有完整连续的基底膜.细胞培养附和实验观察到种子细胞可以在基质上良好生长.动物移植实验未见明显的炎症反应与排斥.结论 经该法脱细胞处理后得到的角膜基质无细胞毒性,组织相容性好,可以成为适宜的组织工程支架材料.
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组织工程活性真皮的构建研究
目的探讨用脱细胞真皮(ADM)、胶原海绵膜(SCM)、胶原凝胶构建活性真皮的可行性.方法从幼儿包皮中纯化、扩增成纤维细胞(Fb),将其分别种植于ADM、胶原凝胶、SCM上,观察细胞增殖及支架收缩等情况.结果Fb在ADM上不能成活;在SCM上增殖良好,人工真皮收缩不明显;在胶原凝胶中增殖活跃,但人工真皮收缩明显.结论利用SCM构建的人工真皮,是一种较理想的活性真皮.
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含有天然钙化软骨层骨软骨支架的研制
目的 构建含有天然钙化层结构的骨软骨支架,为组织工程修复骨软骨缺损提供一种理想的支架材料. 方法 选择新鲜成年猪膝关节为制备原料,切取软骨层用以制备Ⅱ型胶原水凝胶;环钻钻取直径8 mm包含天然钙化层结构的骨柱,进行脱细胞处理,组织学切片染色观察脱细胞情况;将Ⅱ型胶原水凝胶接种于含天然钙化层结构脱细胞骨柱上,冻干,10/L京尼平乙醇溶液交联,即得含天然钙化层结构的骨软骨模型,进行细胞接种及扫描电镜观察. 结果 含天然钙化层结构的脱细胞骨柱脱细胞效果良好,HE染色、甲苯胺蓝染色、固绿番红O染色及DAPI染色切片显示细胞清除彻底;构建复合支架中Ⅱ型胶原海绵支架空隙率为(91.1±3.8)％,孔径大小为(79.7±17.1)μm;脱细胞骨支架的孔隙率为(73.5±2.6)％,孔径大小为(470.2±158.8) μm;共建骨软骨模型细胞共培养扫描电镜观察可见细胞进入骨软骨模型并且生长良好. 结论 含有天然钙化层结构的骨软骨支架具有良好的生物相容性及合适的孔径及孔隙率,可能成为组织工程骨软骨缺损修复的理想材料.
