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碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓干细胞与韧带成纤维细胞共培养效应
背景：碱性成纤维细胞生长因子在韧带损伤愈合中具有重要作用，细胞因子转染的骨髓间充质干细胞可作为种子细胞应用于韧带组织工程。
目的：探讨人碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞三维共培养后的交互生物学效应。
方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞，传至第3代后分为3组：对照组、Ad-EGFP组及Ad-bFGF组。各组细胞相应处理后分别与韧带成纤维细胞三维共培养，MTS法检测细胞增殖能力，ELISA法检测各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白水平，RT-PCR检测各组两种细胞中Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白等相关基因mRNA表达量的变化。
结果与结论：腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子可高效转染骨髓间充质干细胞；共培养3，6 d后，与对照组及Ad-EGFP组相比，Ad-bFGF组两种细胞增殖活性增强(P<0.01)；上清液中碱性成纤维细胞生长因子表达明显增高(P<0.01)，韧带成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白mRNA表达均降低(P<0.01)，骨髓间充质干细胞中Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达均明显升高(P<0.01)。以上结果表明碱性成纤维细胞生长因子转染的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞三维共培养促进韧带成纤维细胞增殖的同时抑制了其胶原合成能力，促进骨髓间充质干细胞增殖的同时增强了其向韧带成纤维细胞分化的能力。 -
Scleraxis和碱性成纤维细胞生长因子-1联合修饰对单层骨髓间充质干细胞向韧带成纤维细胞特异性分化的影响
目的 探讨共培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)和韧带成纤维细胞(LFs)经Scleraxis和人碱性成纤维细胞生长因子-1(bFGF-1)联合修饰后,细胞活性、增殖能力和韧带特异性基因及蛋白表达和合成情况.方法 取3个月龄SD大鼠12只,通过密度梯度离心法结合贴壁法分离培养BMSCs,胶原酶消化法获得LFs.取第3代BMSCs和LFs,实验分为6组,分别为未诱导单纯BMSCs组(A组)、未诱导单纯LFs组(B组)、未诱导单层共培养组(C组)和诱导后单纯BMSCs组(D组)、诱导后单纯LFs组(E组)、诱导后单层共培养组(F组).倒置相差显微镜及噻唑蓝(MTT)法观测各组细胞生长情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度;实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测韧带特异性蛋白(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞黏合素C、基质金属蛋白酶-2)基因表达.结果 倒置相差显微镜观察,共培养细胞可形成一单细胞层生长,F组快融合至90％以上.MTT检测结果显示,培养9d时,F组吸光度(A)值高,D组次之,B组低,与其余组比较差异均有统计学意义(F=1.281,1.593,P＜0.05);A、C、E组间比较差异无统计学意义(F=0.482,0.529,P＞0.05).ELISA检测结果显示细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度中,F组浓度显著高于其余各组(F=2.282,P＜0.05);比较Ⅰ型胶原蛋白浓度,B、C组间及D、E组间比较差异无统计学意义(F=0.482,0.529,P＞0.05).比较Ⅲ型胶原蛋白浓度,C组显著高于B组,E组高于D组,差异均有统计学意义(F=1.830,1.938,P＜0.05).A～F组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度比值分别为1.17、1.19、1.10、1.25、1.17、1.18,D组明显高于其余组.FQ-PCR检测结果显示,Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤维连接蛋白基因表达量F组高,细胞黏合素CD组高,基质金属蛋白酶2E组高,与其余各组比较差异均有统计学意义(F=1.689,P＜0.05).结论 单层共培养BMSCs和LFs经Scleraxis和bFGF-1诱导后,细胞活性、增殖能力、韧带特异性基因及蛋白均增高,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一.
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钒酸盐对尿道下裂术后尿道瘢痕成纤维细胞的影响
尿道下裂是小儿外科常见疾病,尿道成形术后常发生尿道狭窄,治疗后易复发,影响手术效果,这始终是小儿泌尿外科十分棘手的难题.尿道狭窄与尿道愈合过程中瘢痕形成有关,因此抑制尿道瘢痕形成的药物成为研究热点.近年来发现钒酸盐作为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂,是促进愈合,抑制瘢痕的有效物质,Ehrlich等[1]研究了钒酸盐对皮肤伤口愈合作用,发现钒酸盐可提高皮肤愈合速度和质量,减少瘢痕形成.钒酸盐还可以抑制韧带成纤维细胞肌动蛋白(a-SMA)过表达,从而抑制瘢痕收缩[2-3].但钒酸盐在防治小儿尿道瘢痕中能否发挥作用值得深入研究,本研究利用人尿道瘢痕成纤维细胞体外培养的方法,观察钒酸盐对成纤维细胞胶原合成及a-SMA表达的影响.
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TGF-β1联合VEGF对人羊膜间充质干细胞向韧带成纤维细胞体外分化作用的研究
目的 探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)是否具有MSCs特性,以及经TGF-β1和VEGF联合诱导后是否具有向韧带成纤维细胞分化的能力.方法 取自愿捐赠的足月产妇胎盘,采用胰蛋白酶胶原酶联合消化法分离培养hAMSCs,流式细胞术检测hAMSCs表型分子,免疫荧光染色检测hAMSCs其角蛋白-19 (cytokeratin-19,CK-19)和波形蛋白表达情况.取第3代hAMSCs,分别使用含TGF-β1和VEGF的L-DMEM/F12成韧带或纤维细胞诱导培养基(实验组)和普通L-DMEM/F12培养基(对照组)培养,细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测两组细胞增殖能力;培养5、10、15d分别采用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测韧带及血管生成相关特异性蛋白和基因表达.结果 倒置相差显微镜观察示hAMSCs呈单层贴壁生长;流式细胞术结果示hAMSCs表达MSCs表型分子;免疫荧光染色示hAMSCs高表达波形蛋白、低表达CK-19;hAMSCs具有向成骨、成软骨及成脂细胞分化的能力.CCK-8法检测示,7d时两组细胞均达增殖高峰,实验组细胞增殖能力于7d后显著高于对照组(P＜0.05).免疫荧光染色示,培养5、10、15d时实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白(Fibronectin)、细胞连接素(Tenascin-C)表达染色均较对照组增强.实时荧光定量PCR结果示,随时间延长实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、VEGF mRNA相对表达量均逐渐上调(P＜0.05).除培养5d两组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、VEGF mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-SMA和VEGF mRNA相对表达量均显著高于对照组(P＜0.05).结论 hAMSCs具有MSCs特征,且体外增殖能力良好,可作为组织工程种子细胞来源;体外诱导后韧带成纤维细胞及血管生成相关特异性基因表达上调,韧带成纤维细胞特异性蛋白分泌增加,TGF-β1联合VEGF可作为构建组织工程韧带的生长因子选择.
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TGF-β1和bFGF-1对单层共培养BMSCs和韧带成纤维细胞韧带特异性的影响
目的 探讨单层共培养BMSCs和韧带成纤维细胞(ligament fibroblasts,LFs)经TGF-β1和bFGF-1诱导后,细胞活性、增殖能力和韧带特异性基因及蛋白表达和合成情况.方法 取3月龄SD大鼠,通过密度梯度离心法结合贴壁法分离培养BMSCs,胶原酶消化法获得LFs.取第3代BMSCs和LFs,实验分为6组,分别为未诱导单纯BMSCs组(A组)、未诱导单纯LFs组(B组)、未诱导单层共培养组(C组)和诱导后单纯BMSCs组(D组)、诱导后单纯LFs组(E组)、诱导后单层共培养组(F组).倒置相差显微镜及MTT法观测各组细胞生长情况;ELISA法检测细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度;实时荧光定量PCR检测韧带特异性蛋白(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞黏合素C、基质金属蛋白酶2)基因表达.结果 倒置相差显微镜观察,共培养细胞可形成一单细胞层生长,F组快融合至90％以上.MTT检测示,培养9d时F组吸光度(4)值高,D组次之,B组低,与其余组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).ELISA检测示细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度中,F组浓度显著高于其余各组(P＜ 0.05),D、E组Ⅰ型胶原蛋白浓度差异无统计学意义(P＞0.05),E组Ⅲ型胶原蛋白浓度高于D组(P＜0.05).A～F组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度比值分别为1.17、1.19、1.10、1.25、1.17、1.18,D组明显高于其余组.实时荧光定量PCR检测示,Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤维连接蛋白基因表达量F组高,细胞黏合素CD组高,基质金属蛋白酶2E组高,与其余各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 单层共培养BMSCs和LFs经TGF-β1和bFGF-1诱导后,细胞活性、增殖能力、韧带特异性基因及蛋白均增高,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一.
