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腹泻性贝类毒素的细胞F-肌动蛋白荧光检测法的建立
目的 通过检测大田软海绵酸(0A)对HL-7702肝细胞的F-肌动蛋白的解聚作用,建立腹泻性贝类毒素(DSP)的荧光检测法.方法 使用鬼比环肽标记F-肌动蛋白,多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光强度的变化分析样品中毒素的含量.比较荧光检测法和ELISA法对贝类样品的检测结果,分析所建荧光检测法的可靠性.结果 OA能明显破坏细胞F-肌动蛋白的聚合.随着作用浓度的增加,破坏程度也随之增加.在2.5 ～40 nmol/L范围内呈现明显的线性关系(R2 =0.9931),检测限值可达到2.01μg/100g贝肉；进行样本检测时,加标回收率为92.76％～96.49％,并与ELISA法检测具有较好的线性相关(R2 =0.830).结论 与现有的检测法相比,F-肌动蛋白荧光检测法具有较好的重复性和较低的检出限,可用于有毒贝类的筛查与检测.
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东海染毒紫贻贝中贝类毒素的分离和鉴定
目的 掌握紫贻贝的染毒情况,对其含有的贝类毒素成分进行分离和鉴定.方法 样品经丙酮提取,提取物经乙醚-水液分配,乙醚可溶部分再经硅胶柱层析粗分离、反相高效液相色谱半制备细分离,UPLC-MS/MS监测.结果 分离得到4个毒素组分,根据质谱数据以及与pectenotoxin-2 (PTX-2)的酶水解产物比较,鉴定组分Ⅰ和Ⅱ分别为pectenotoxin-2 seco acid (PTX-2sa)和7-epi-PTX-2 seco acid( 7-epi-PTX-2sa),经LC-MS/MS分析与标准品对照鉴定组分Ⅲ和Ⅳ分别为大田软海绵酸(OA)和鳍藻毒素-1(DTX-1).结论 从苍南县市售贻贝中同时分离出腹泻性贝类毒素(DSP)和扇贝毒素类(PTXs),其中游离态的OA、DTX-1及总OA含量超过欧盟限量值,为这次腹泻性贝类中毒的主要原因.
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腹泻性贝类毒素细胞F-肌动蛋白荧光检测法条件优化
目的 优化腹泻性贝类毒素(DSP)样品提取方法,建立更加可靠的DSP细胞F-肌动蛋白荧光检测法.方法 使用鬼比环肽标记F-肌动蛋白,多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光强度的变化分析样品中毒素的含量.检测34份贝类样品加碱水解处理前后DSP含量,比较两种提取方式下结果的差异,并同步使用ELISA法进行比对,分析所建方法的可靠性.结果 优化后的贝类样品检测法实验平均变异系数6.46％,平均加标回收率92.75％.优化后的贝类样品提取法大田软海绵酸(OA)含量高于原方法和ELISA法,所检测到的OA浓度与原方法比较差异具有统计学意义(t=-8.227,P=0.000).结论 使用加碱水解提取DSP的方法具有较好的重复性和回收率,很大程度上提高了DSP细胞F-肌动蛋白荧光检测法的检出率.
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大田软海绵酸液相色谱串联质谱检测方法的研究
目的:利用高效液相色谱-串联质谱法建立海产品中大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)的检测方法.方法:贝样品提取液经AccuBondⅡ SPE silica固相萃取小柱预分离和富集,用三级四极杆串联质谱(MS/MS)作为HPLC的检测器,使用正离子电喷雾(ESI)电离方式,多反应监测(MRM)扫描模式,选择母→子离子对m/z 827→m/z 723,m/z 827→m/z809作为定量检测的离子对,HPLC的流动相为乙腈:1%甲酸-水(体积比70∶30),色谱柱为Agilent Extend-C18(2.1×150 mm,Ф5.0 μm),对OA标准品及加标样品和实际样品进行HPLC-MS/MS检测.结果:方法线性回归方程为Y=193.07X-780.6(Q1/Q3:m/z 827.4→723.5);Y=83.021X-335.6(Q1/Q3:m/z 827.4→809.5),相关系数r2均为0.9991;线性范围为10～800 μg/L.样品平均回收率为83.99%,平均RSD为4.34%.结论:建立的HPLC-MS/MS方法灵敏、快速、准确,可用于海产品中贝类样品OA限量标准检测.
关键词： 大田软海绵酸 高效液相色谱-串联质谱法 固相萃取 贝 -
抗大田软海绵酸单克隆抗体的制备及免疫学特性分析
制备了赤潮毒素大田软海绵酸(okadaic acid,OA)单克隆抗体,并分析其免疫学特性.方法用人工抗原大田软海绵酸-小牛血清蛋白偶联物( OA-BSA)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术经初筛、复筛和亚克隆,筛选到1株可稳定分泌抗OA单克隆抗体的杂交瘤细胞株3H4.对抗体效价、亚型、特异性、敏感性进行免疫学鉴定与分析.结果抗体亚型为IgG2b;腹水效价为1∶1.28×106;50％抑制质量浓度为2.852 ng/ml;低检测限为0.45 ng/ml;电泳结果显示抗体,由1条重链和1条轻链组成；与OA同系物PTX1、GYM、SPT1、YTX交叉反应率为0.结论制备的OA单抗效价和特异性均较好,可用于OA的免疫学检测.
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高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱测定腹泻性贝毒研究
高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱(LC/Q-TOFMS)联用技术对贝类样品的腹泻性贝毒大田软海绵酸(OA)进行了检测研究.样品经甲醇-水(体积比为8:2)提取,正己烷、氯仿液-液分配及硅胶柱净化后,用Zorbax Extend C18柱(150×2.1mm,5μm)色谱分离,以乙腈-0.05%乙酸水溶液(体积比为7:3)作流动相,流速为0.20mL/min.Q-TOF MS选择电喷雾正离子模式,OA主要与钠离子缀合,以[M+Ma]+作为前体离子进行TOFMS扫描.结果表明,样品加标的平均回收率为89%～93%间,相对标准偏差为9%～10%,检测低限(LOQ)为0.1μg/g.由于Q-TOF MS具有高分辨率,能进行精确质量测定而不降低灵敏度,因此本方法作为确证分析方法具有高灵敏度和选择性.
关键词： 高效液相色谱 四极杆-飞行时间质谱 腹泻性贝毒 大田软海绵酸 贝类 -
大田软海绵酸诱导细胞凋亡的机制
大田软海绵酸是一种公认的促癌剂,也是腹泻性贝类毒素的主要成分之一,主要由共生于大田软海绵和隐瓜海绵中的利马原甲藻所产生,它在细胞的生长、分化、代谢和死亡中都起着重要的调节作用.现在它已作为一种非常有效的生物工具药被广泛用于基础生命科学的研究,其中有关它对不同细胞株的复杂凋亡诱导机制更是得到了普遍的关注和重视.本文主要概述Fas-FasL,Caspase,Bcl-2和p53等在大田软海绵酸(okadaic acid,OA)诱导的细胞凋亡机制中的作用.
