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Dlx2基因过表达与前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中的细胞凋亡和周期调控
背景:Dlx2 基因在颅神经嵴细胞迁徙进入第一鳃弓过程和颅颌面骨骼发育中起重要作用,但Dlx2 基因对成骨细胞分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响尚未见报道.目的:观察Dlx2 基因过表达对前成骨细胞系MC3T3-E1 成骨分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响.方法:构建反转录病毒pMSCV-puro-Dlx2 并转染矿化诱导液培养下的MC3T3-E1 细胞,构建稳定过表达Dlx2 基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2.RT-PCR 和Western blot 验证Dlx2 基因过表达细胞系的建立.Annexin V/PI 双染色后流式细胞分选检测细胞凋亡,PI/RNase 双染色后流式细胞分选检测细胞周期变化.结果与结论:实验成功构建稳定过表达Dlx2 基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2.发现Dlx2 基因过表达促进细胞凋亡(P < 0.05),同时阻滞细胞周期于G1/G0 期(P < 0.05),减低细胞增殖性,促进细胞分化行使功能.
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利用慢病毒载体构建稳定过表达人VEGF165的小鼠巨噬细胞系
目的:通过构建人血管内皮生长因子165 (human VEGF165,hVEGF165)的慢病毒载体,感染小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,建立稳定高表达人VEGF165的小鼠巨噬细胞系.方法:将聚合酶链反应(PCR)扩增得到的hVEGF165和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1双酶切后连接,构建慢病毒表达载体pLVX-hVEGF165-IRES-ZsGreen1.再经双酶切和测序鉴定后,进行病毒包装及浓缩.将该慢病毒载体感染RAW264.7细胞,利用绿色荧光蛋白ZsGreen1进行2次流式分选.用Realtime-PCR、WesternBlot分别检测各组细胞中hVEGF165的mRNA和蛋白表达;ELISA分别检测细胞上清中人VEGF和小鼠VEGF的含量.结果:酶切及测序结果示慢病毒表达载体pLVX-hVEGF165-IRES-ZsGreen1构建正确;流式分选后得到高纯度的ZsGreen 1-hVEGF165-RAW264.7细胞.Real time-PCR、Western Blot显示该细胞特异高表达hVEGF165基因和蛋白(P均＜0.01).ELISA显示该细胞分泌人和小鼠VEGF均显著增加(P均＜0.01).结论:成功构建hVEGF165慢病毒表达载体,并建立稳定高表达hVEGF165的小鼠巨噬细胞系.为深入研究该细胞的功能、机制及应用提供充足稳定的细胞来源.
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SHIP1基因过表达非小细胞肺癌细胞系的建立及其对细胞增殖能力的影响
目的:观察SHIP1对NSCLC细胞增殖的影响.方法:由NCBI Gene数据库查询获得人SHIP1基因CDS区,插至载体pTSB-CMV-MCS-SBP-3F1ag-EGFP,构建SHIP1真核过表达质粒;进一步利用其构建SHIP1过表达慢病毒.用该慢病毒感染A549、SPCA-1和PC-9细胞株,获得SHIP1急定过表达NSCLC细胞系.Western blotting和qRT-PCR分别从蛋白水平和mRNA水平检测SHIP1的表达变化.采用MTT法和克隆形成实验检测过表达SHIP1的PC-9细胞增殖活力和克隆形成能力.Western blot-ting检测AP-1蛋白复合体各组分的表达.结果:SHIP1真核过表达质粒经测序证实构建成功.稳定过表达SHIP1的A549、S-PCA-1和PC-9细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光.与阴性对照组比较,细胞中SHIP1在mRNA(P＜0.01)及蛋白水平均明显升高.在PC-9细胞中,过表达SHIP1使细胞增殖、克隆形成能力降低(均P＜0.01),p-c-Jun、FosB等表达降低.结论:成功构建了稳定过表达SHIP1的A549、SPCA-1和PC-9细胞模型;过表达SHIP1可通过抑制AP-1家族蛋白抑制NSCLC细胞增殖能力.
关键词： 多磷酸肌醇-5-磷酸酶 非小细胞肺癌 基因重组 稳定过表达 细胞增殖 -
稳定过表达人MGST1基因抑制肺腺癌细胞SPC-A-1的凋亡
目的:建立稳定过表达微粒体谷胱甘肽S转移酶1(microsomal glutathione S-transferase 1,MGST1)基因的市腺癌SPC-A-1细胞系,探讨MGST1在肺腺癌中的作用及其机制.方法:重组质粒pcDNA3-MGST1和空载体pcDNA3以脂质体介导的方法转染至SPC-A-1细胞中,经过G418筛选稳转细胞系,标记为pcDNA3-MGST1细胞和空载体pcDNA3细胞.实时荧光定量PCR及Western blotting鉴定稳转细胞中MGST1 mRNA和蛋白的表达情况.MTS法检测稳转细胞的活力;流式细胞仪和Western blotting检测H2O2诱导下稳转细胞的凋亡率和下游凋亡相关蛋白水平变化.结果:酶切鉴定和测序结果显示pcD-NA3-MGST1重组质粒构建成功,并获得具有G418抗性的稳转细胞株.pcDNA3-MGST1细胞中MGST1在mRNA和蛋白水平表达均显著升高(P＜0.01),且细胞活力明显增加(P＜0.05).H2O2诱导下,pcDNA3-MGST1细胞的早期凋亡率明显低于pcDNA3组[(3.30±0.40)％vs(6.50±0.95)％,P＜0.05];pcDNA3-MGST1细胞凋亡相关蛋白caspase 9、caspase 3、PARP表达增多,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP表达明显减少.结论:本研究成功构建了稳定过表达MGST1的SPC-A-1肺腺癌细胞系,MGST1可能通过调节caspase凋亡通路抑制肺腺癌细胞的凋亡.
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过表达整合素链接激酶通过NF-κB通路促进脑胶质瘤细胞的上皮间质转化
[目的]研究过表达整合素链接激酶(ILK)对胶质瘤细胞上皮间质转化(EMT)的调控作用及初步机制.[方法]项目组前期实验已经成功构建了重组质粒pEGFP-C 1-ILK,并将其转染给SHG-44胶质瘤细胞,通过G418筛选出了稳定转染的细胞株.实验分组如下:SHG-44(空白对照组)、pEGFP-C1(空载组),及pEGFP-C 1-ILK(稳转组),先检测各组中ILK的表达情况(RNA及蛋白质水平)及侵袭能力,再检测过表达ILK后对EMT标记物的影响,后再分别应用NF-κB通路的特异性阻断剂BAY 11-7028和RNA沉默的方法阻断核因子NF-κB通路,Western blot方法检测上皮间质转化标记物E-cadherin在阻断前及阻断后的表达情况,初步探讨NF-κB通路在过表达ILK的胶质瘤细胞中对EMT的调控作用.[结果]稳转组中ILK明显过表达,同时侵袭能力增强(Transwell小室透膜细胞数在对照组、空载组和稳转组分别为:92,87,229).Western blot检测EMT标记物蛋白的表达:稳定转染组中snail,slug,twist,vimentin的表达较对照组及空载组的表达明显增高,而E-cadherin的表达则在稳定转染组中明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).当分别用NF-κB特异性阻断剂BAY 11-7028及p65 siRNA的方法阻断该通路后,稳定转染组中E-cadherin蛋白表达明显升高.[结论]胶质瘤中过表达ILK可使侵袭能力增强,同时可下调E-cadherin,上调vimentin及Snail,Slug,Twist的表达,可能通过此机制促进脑胶质瘤细胞的上皮间质转化,NF-κB通路可能参与、调控该进程.
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稳定过表达人SIRT1基因的HEK293细胞系的建立
目的:构建人沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)基因的真核表达载体,建立稳定过表达人SIRT1的HEK293细胞系.方法:将含有SIRT1的克隆载体pCRⅡ-TOPO-SIRT1双酶切后,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,连接产物经酶切鉴定后进行测序.构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-SIRT1转染HEK293细胞.G418进行筛选.Real-time PCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白水平检测SIRTI的表达.结果:酶切分析和测序结果证实,SIRT1基因成功插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中.Real-time PCR和Western Blot结果显示稳定转染pc:DNA3.1(+)-SIRT1的HEK293细胞SIRT1的表达水平明显高于未转染细胞(P<0.01).结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-SIRT1,并建立了稳定过表达SIRT1基因的HEK293细胞系.为进-步研究SIRT1基因在心血管疾病中的作用及其机制奠定了基础.
