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根皮苷对LO2正常人肝细胞体外细胞毒性的实验研究
目的 探究根皮苷对正常人肝细胞LO2的体外细胞毒性.方法 实验分为正常组和根皮苷组.将从甜茶中提取根皮苷配以不同浓度根皮苷的培养液,浓度分别为4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L.分别在24、48和72 h,使用MTT比色法测定并计算出细胞活力率.结果 给药24、48和72 h后,根皮苷在4.0～1 000 μmol/L浓度的范围内对正常人肝细胞LO2无毒性作用,细胞的存活率在90％以上.结论 在4.0 ～1 000 μmol/L浓度范围内,根皮苷对正常人肝细胞的正常增殖无明显抑制,未显示有肝细胞毒性作用.
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海藻甲醇提取物免疫调节作用的初步研究
目的:为了从海藻中寻找天然药物活性前体,对山东沿海的39种海藻甲醇提取物进行了免疫调节活性分析.方法:采用MTT法检测海藻甲醇提取物对小鼠体外脾细胞毒性及T、B淋巴细胞的增殖作用.结果:海藻对T和(或)B淋巴细胞具有ConA或LPS协同刺激作用(或抑制作用),其中16种有明显的剂量依赖性,6种出现小剂量增殖、大剂量抑制的双向调节作用.结论:海藻甲醇提取物具有一定免疫调节功能,为日后进一步从海藻中开发药源性活性成分奠定了基础.
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肠致病性大肠杆菌外膜蛋白免疫保护性研究
目的:观察免疫家兔对肠致病性大肠杆菌外膜蛋白的免疫应答.方法:以提纯的兔源致病性大肠杆菌WF0305菌株的外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)皮下注射免疫组家兔,对照组仅注射佐剂,于免疫前及免疫后38天分别收集血清,以间接ELISA法检测血清中的抗体效价,同时用免疫血清与菌株做玻板凝集试验和保护力试验;采用MTT法检测OMP对体外脾淋巴细胞特异性增殖反应.结果:免疫组的家兔在三免后免疫血清中抗OMP的抗体效价可达1∶25 600;免疫血清均能与WF0305菌株、WF0408菌株、WF0504菌株发生直接凝集反应,且效价均能达到1∶16以上,小鼠的半数保护量均在0.03～0.06 ml之间.采用MTT法检测OMP对体外脾淋巴细胞特异性增殖反应,证明OMP对脾淋巴细胞的增殖有明显增强作用(P＜0.01).结论:OMP可诱导兔对大肠杆菌的特异性体液免疫和细胞免疫应答,说明OMP具有较好的免疫原性,且对大肠杆菌感染有一定的保护力.
关键词： 致病大肠杆菌 外膜蛋白(OMP) 间接酶联免疫吸附试验 MTT -
抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测
目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础.方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27 b-A-hIL-1β-scFv.将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白.利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力.结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化.得到纯度为72.05％、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白.ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力.MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖.结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础.
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中药马勃促大鼠成纤维细胞增殖的有效成分
目的 通过实验筛选出马勃中促大鼠成纤维细胞增殖的有效成分.方法 利用极性不同的溶剂分离提取马勃的主要组分,作用于体外培养的成纤维细胞,观测各组分对成纤维细胞生长的影响,筛选出作用强的组分,并利用质谱等方法确定有效成分.结果 80％乙醇提取物对成纤维细胞增殖作用明显,并筛选出对成纤维细胞增殖作用较强的有效成分.结论 分析得到其有效成分可能为萜类化合物.
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白藜芦醇对肺癌A549细胞增殖及NF-κB表达的影响
目的 研究白藜芦醇对肺癌细胞A549增殖与NF-κB表达的影响.方法 采用MTT法检测白藜芦醇对A549细胞增殖的影响；采用RT-PCR法检测白藜芦醇对A549细胞NF-κB mRNA表达的作用；用Western印迹法检测白藜芦醇作用后NF-κB在A549中的表达.结果 白藜芦醇对A549细胞增殖抑制作用具有时间与剂量依赖性；白藜芦醇作用48 h后可以明显抑制NF-κB mRNA和蛋白的表达.结论 白藜芦醇可以抑制A549细胞增殖及NF-κB在其中的表达.
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靶向survivin的RNAi联合X线照射对肺腺癌A549细胞周期、凋亡及增殖的影响
目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察其联合X射线照射对肺腺癌A549细胞周期、凋亡及增殖影响.方法 根据GenBank中survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,联合5 Gy射线照射,应用PI单染、流式细胞仪检测细胞周期与凋亡变化,MTT检测细胞增殖的变化.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;转染空载体pGenesil2对细胞G0/G1期、S期及凋亡,增殖能力影响不大,降低了G2/M期(P＜0.05);而干扰质粒pGenesil2-survivin能延长G0/G1期,缩短S期,诱导细胞凋亡增加,降低细胞增殖能力(P＜0.05);5 Gy照射对细胞周期影响不大,增加细胞凋亡,降低增殖能力(P＜0.05);转染pGenesil2-survivin后,进行5 Gy X射线照射,延长G0/G1期,缩短S期,诱导细胞凋亡增加,降低细胞增殖能力(P＜0.05,P＜0.01).结论 靶向survivin的RNAi可延长G0/G1期,缩短S期,增加细胞凋亡,降低细胞增殖能力,X射线照射能够增强该质粒的作用.
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芬太尼与5-氟尿嘧啶联合应用对MCF-7乳腺癌细胞增殖与细胞周期的影响
目的：研究芬太尼与5-氟尿嘧啶（ FU）联合应用对人乳腺癌细胞（ MCF-7）增殖与细胞周期的影响。方法药物作用24、48、72 h后噻唑蓝（ MTT）法测定MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制情况，选取48 h，通过流式细胞技术（ FCM）检测细胞周期情况。结果增殖抑制情况：芬太尼单独应用时，与未处理组相比，均引起平均增殖抑制率（IR）增加（P＜0.05）；三种浓度的芬太尼与5-FU联合应用作用48、72 h时，均具有协同作用（P＜0.05）；平均IR随着其中芬太尼浓度增加依次增加。细胞周期影响：单独应用芬太尼处理时，G0／G1期细胞比例随着芬太尼浓度的增加依次增加（P＜0.05），S期比例依次降低（P＜0.05），增殖指数（PI）亦依次降低。联合用药时，G0／G1期细胞比例随其中芬太尼浓度的增加依次增加（P＜0.05）， S期、G2／M期细胞、PI随芬太尼浓度的增加依次降低（P＜0.05）；三种浓度芬太尼与5-FU联合应用，在对 G2／M期细胞比例和 PI减少方面均具有协同作用（P＜0.05）。结论一定浓度的芬太尼、5-FU及联合应用对MCF-7乳腺癌细胞有增殖抑制作用，两药联合应用，既抑制了 G0／G1期到 S期的转化，又抑制了S期向G2／M期的转化，可显示出协同作用。并且对增殖抑制和细胞周期的影响也与芬太尼的浓度有一定的剂量-时间依赖关系。
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人参二醇皂甙抑制人乳腺癌细胞增殖的实验研究
目的 观察人参二醇组皂苷(PDS)对人乳腺癌细胞MCF7的抑制作用.方法 观察PDS作用后MCF7细胞的形态学改变;利用MTT法检测PDS作用后MCF7细胞的生长抑制率.结果 PDS作用后的MCF7细胞生长状态变差,细胞变圆漂浮在培养液中;MTT结果显示:细胞生长明显受到抑制,72 h生长抑制率可达到80.6%;且生长抑制率呈时间依赖性和剂量依赖性.结论 PDS对人乳腺癌细胞MCF7有抑制作用.
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原代培养的皮质神经元缺血性损伤模型的建立
目的 建立方便有效的神经元拟缺血性损伤的离体模型.方法 以原代培养Wistar大鼠乳鼠大脑皮层神经元为研究对象,不同浓度H2O2及Glu与细胞作用24h后,检测细胞活力,LDH漏出量及细胞形态学改变.结果 6.25μmol/L～200μmol/L H2O2及12.5μmol/L～50μmol/L Glu均可降低神经元生长能力,增加乳酸脱氢酶漏出量;细胞形态有不同程度病理变化.结论 H2O2与Glu引起的细胞损伤模型是两种方便有效的神经元拟缺血性损伤模型.
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大鼠肝细胞的分离及原代长期培养
目的：研究大鼠肝细胞分离的简易方法及长期培养过程中肝细胞形态变化过程。方法：采用体外胶原酶二步灌注法分离大鼠肝细胞，TB染色法计算细胞数及细胞活率。MTT法观测新生牛血清对大鼠肝细胞增殖的影响。在含10％新生牛血清及其他附助因子的Williams＇E条件培养基中原代长期培养，并进行形态学的动态观察。结果：平均每只大鼠可获取2．26×108个肝细胞，平均活力为95．6％。新生牛血清浓度与大鼠肝细胞增殖有明显的量效关系(P＜0．01)。在Williams＇E培养基中可存活5～6周并保持正常形态。结论：本方法分离的肝细胞有较高的获取率和活力，适合体外长期原代培养。
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四磨汤对胃肠道Cajal间质细胞的体外增殖干预作用
目的:探讨四磨汤对胃肠道Cajal间质细胞(Interstitial Cells of Cajal,ICC)体外增殖的干预作用,为四磨汤对胃肠动力障碍性疾病的临床治疗提供实验依据.方法:采用Ⅱ型胶原酶消化法体外培养ICC,通过直接给药和含药血清2种给药途径研究四磨汤对胃肠道ICC的体外增殖干预作用.结果:采用MTT法对ICC的增殖干预作以评价,通过直接给药途径:四磨汤中、高剂量组均有促进细胞增殖作用,与空白对照组比较有显著的统计学意义(P＜0.01);通过含药血清给药途径:给药各组均与空白对照组比较有显著统计学意义(P＜0.01),其中10％、20％浓度的四磨汤组具有促进ICC增殖作用,而30％浓度组呈现对体外ICC有抑制增殖作用.结论:通过直接给药途径四磨汤低剂量组与空白对照组比较无统计学意义,中、高剂量组对ICC具有提高增殖率作用;通过含药血清给药途径四磨汤10％、20％含药血清组具有提高ICC增殖率的作用,而30％含药血清组的细胞增殖率低于空白对照组,有抑制ICC的趋势.结论:四磨汤在一定浓度及给药途径下能促进ICC的增殖.
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地黄饮子含药脑脊液对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤后生存状态和活力的保护作用
目的:探讨古方地黄饮子对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)所致PC12细胞损伤后生存状态和活力的保护作用.方法:把离体培养的进入对数生长期的PC12细胞分为6组:空白对照组、模型对照组、VitE脑脊液组、地黄饮子脑脊液低、中、高剂量组.待24h细胞贴壁后吸去培养液,分别加入空白培养液、正常脑脊液、VitE脑脊液、中药脑脊液低、中、高剂量,加培养液补至等量,37℃孵育2h.然后除空白组之外的各组加入经老化处理的Aβ25-35(终浓度为10μmol/L),建立AD细胞模型.空白组加入等量的培养液,继续孵育24h后收集培养液,对培养液进行MTT法和LDH法检测细胞生存活力.结果:地黄饮子能升高MTT代谢率,降低LDH释放.结论:地黄饮子能改善Aβ25-35损伤后的PC12细胞生存状态,提高细胞生存活力.
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独角莲乙醇提取物体外抗肿瘤实验研究
目的:通过独角莲20%乙醇提取物对人胃腺癌MGC-803、肝癌Hep-2、肺癌A549、乳腺癌MCF-7细胞杀伤率、半数抑制浓度的测定,确定对独角莲20%乙醇提取物的佳敏感瘤株并通过透射电镜观察药物作用后该肿瘤细胞形态的变化.方法:1.采用体外细胞培养技术用MTT法,检测药物对各肿瘤细胞的生长抑制作用.2.透射电镜观察药物作用96h的肿瘤细胞形态.结果:独角莲20%乙醇提取物对胃癌MGC-803、肝癌Hep-2、肺癌A549、乳腺癌MCF-7细胞的生长有抑制作用,与细胞作用72h时的IC50分别为(74.14±5.29)mg/mL、(81.61±6.14)mg/mL、(128.26±11.43)mg/mL、(120.26±9.46)mg/mL,与细胞作用48h时的IC50分别为(94.55±6.85)mg/mL、(108.94±8.69)mg/mL、(187.78±9.87)mg/mL、(280.54±14.51)mg/mL;透射电镜观察结果表明独角莲20%乙醇提取物能使MGC-803细胞发生凋亡.结论:独角莲20%乙醇提取物对胃癌MGC-803瘤株敏感且可使该瘤细胞发生凋亡.
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五味子超临界萃取物对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤后生存状态和活力的保护作用
目的:研究五味子超临界萃取物对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)所致的PC12细胞损伤后生存状态和活力的保护作用.方法:体外培养PC12细胞,建立Aβ引起的细胞损伤的AD细胞模型,采用MTT法和LDH法检测细胞生存活力.结果:五味子超临界萃取物能降低LDH含量,升高细胞线粒体脱氢酶的活性,增加活细胞数.结论:五味子超临界萃取物能减轻Aβ25-35损伤后的PC12细胞的受损程度,保护细胞膜,提高细胞生存活力.
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当归多糖的酶法提取新工艺研究
目的:研究当归多糖的酶法提取新工艺,并就提取多糖的抗肿瘤活性进行评价.方法:采用生物酶辅助提取技术进行当归多糖提取工艺研究,选用单因素实验探索酶用量、酶解温度、酶解种间及pH值对当归多糖提取率的影响,在单因素实验的基础上,采用正交试验对工艺条件进行优化,并采用MTT法评价当归多糖对hela细胞的抗肿瘤活性.结果:各因素对提取效果影响由大到小依次为:酶浓度＞酶解时间＞ pH值＞酶解温度,佳提取工艺条件为,纤维素酶浓度:0.4mg/mL、提取温度:60℃、提取时间:4h,pH =5.0,当归多糖得率为150.34mg/g,MTT结果证实提取多糖具有一定的抗肿瘤活性.结论:该工艺操作简单,成本较低,本研究为当归多糖的深度开发提供了科学依据.
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狼毒大戟中巴豆烷型二萜的抗肿瘤活性研究
目的:研究狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.)中巴豆烷(Tigliane)型二萜的抗肿瘤活性.方法:采用硅胶柱色谱、ODS、Sephadex LH-20分离化学成分,根据理化性质和波谱数据确定化合物结构,并对得到的化合物进行抗肿瘤活性研究.结果:从狼毒大戟中共分离鉴定了3个巴豆烷型二萜化合物,分别为:prostratin(1)、Langduin A(2)和13-O-Acetylphorbol (3),同时利用肝癌HepG-2细胞、胃癌SGC-7901细胞和乳腺癌MCF-7细胞进行抗肿瘤实验.结论:在MTT抗肿瘤实验中,化合物prostratin对肝癌和乳腺癌有显著的抗肿瘤活性、Langduin A对胃癌和乳腺癌有抗肿瘤活性、13-O-Acetylphorbol仅对乳腺癌有抗肿瘤活性.
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MTT法检测没食子酸对两种细胞的体外毒性
目的:探讨抗肿瘤单体没食子酸(GA)对体外培养的正常人肝细胞株LO2和肝癌细胞株SMMC - 7721的毒性.方法:采用MTT实验分析GA对LO2和SMMC - 7721的增殖抑制作用.结果:GA作用24h、48h、72h后,用药组均出现了不同程度的增殖抑制.结论:抗肿瘤单体GA对LO2和SMMC - 7721细胞均有一定的毒性,表现为增殖抑制作用,作用早期(24h)对LO2的抑制大于对SMMC - 7721的抑制,连续作用后(48h、72h),对SMMC - 7721细胞的损伤明显超过对LO2的抑制.
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蝙蝠葛碱抑制肺癌细胞QG-56增殖的实验研究
目的:研究蝙蝠葛碱的抗肿瘤作用.方法:采用MTT法测定蝙蝠葛碱对肿瘤细胞增殖反应的影响.结果:蝙蝠葛碱(Dau)能有效抑制癌细胞株QG-56细胞增殖,MTT分析结果显示,与溶剂对照组相比,Dau在3.125～50μg·mL-1浓度范围内对细胞增殖有明显的抑制作用,抑制率随着Dau浓度的增加而增加,存在明显的剂量-效应关系.不同浓度Dau之间的抑制率比较,具有统计学差异(P<0.05),以22μg·mL-1 Dau作用72h抑制率高(91.23%).结论:蝙蝠葛碱有明显的抑制肿瘤细胞株增殖反应的作用.
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半枝莲含药血清对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响
目的:探讨半枝莲含药血清对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及其机制.方法:体外常规培养人卵巢癌SKOV3细胞,倒置显微镜下观察半枝莲含药血清作用后SKOV3细胞形态的改变,MTT法检测细胞增殖抑制率,应用流式细胞技术检测细胞周期及凋亡率.结果:与空白对照组比较,给药后细胞状态变差,形态和贴壁情况等发生改变.半枝莲含药血清可有效抑制SKOV3细胞生长,低、中、高剂量组抑制率呈递增趋势,同剂量组24 h、48 h、72 h抑制率递增.流式细胞仪检测结果显示,与空白对照组比较,半枝莲含药血清组G0/G1期细胞所占比例增多,空白对照组、半枝莲含药血清低、中、高剂量组48 h细胞凋亡率分别为7.94％、8.36％、17.82％、21.12％.结论:半枝莲含药血清对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖有抑制作用,其机制与影响细胞周期和诱导细胞凋亡有关.
