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C57BL/6小鼠来源的胚胎干细胞建系及体外定向造血分化的研究
哺乳动物的胚胎造血表现为时间和空间的连续变化.既往研究表明,129小鼠来源的胚胎干细胞系(em-bryonic stem cells,ES细胞)的体外分化能在一定程度上模拟胚胎造血.为研究C57BL/6小鼠来源的ES细胞系体外定向造血细胞分化的特点,分离C57BL/6小鼠3.5天囊胚的内细胞团建立ES细胞系并采用常规方法鉴定,应用体外二步分化法形成拟胚体并进行集落培养,细胞化学染色和RT-PCR鉴定造血前体细胞.结果表明:所建ES细胞系MES-1符合建系标准,其体外分化后可在不同阶段的拟胚体中发现多种造血前体细胞的有序出现,包括原始红系前体细胞,永久红系前体细胞,混合集落形成细胞和粒单系集落形成细胞.RT-PCR分析显示,拟胚体表达多种造血特异性的转录因子和造血标记.结论:自C57BL/6小鼠建立的ES细胞系MES-1体外定向造血细胞分化在一定程度上能模拟胚胎造血.
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小鼠胚胎AGM区Flk-1+细胞的造血特性
本研究旨在考察Flk-1分子在胚胎期10.5 d(E10.5)的主动脉-性腺-中肾区(AGM区)不同类型造血前体细胞的表达情况.通过流式细胞术分析发现低于10%的Flk-1+细胞与CD41、CD45/Ter1 19有共表达,继而分选出CD31+ CD45-Ter119-Flk-1+ CD41+(R1,代表不成熟的造血前体细胞)和CD31+CD45-Ter119-Hk-1+CD41-(R2,代表内皮细胞)两群细胞,利用造血集落培养和OP9共培养体系分别考察其体外的髓系与淋系潜能.结果表明:仅R1组细胞能在造血集落培养体系中形成典型的造血集落,但与OP9共培养7-9d后,两组细胞均能产生丰富的造血前体细胞(CD45+ c-Kit+)、髓系细胞(Gr-1+/Mac-1+)、红细胞(Ter119+)和B淋巴细胞(CD19+).结论:E10.5的小鼠胚胎AGM区Flk-1仍然在幼稚的造血前体细胞以及更早期的生血内皮细胞表达,但是此时的造血干细胞前体和造血干细胞是否表达Flk-1仍需通过体内功能实验明确.
关键词: 主动脉-性腺-中肾区 造血前体细胞 内皮细胞 淋巴细胞 Flk-1 -
破骨细胞分化中的信号环路与调节
骨的形态、结构通过不断的形成与吸收来维持.形成与吸收的不平衡造成以骨量改变为特征的代谢性骨病,如骨质疏松(Osteoporosis)和石骨症(Osteopetrosis).而骨的生长、发育和维持是一个高度调节过程,受全身和局部因子调节.基因在其中起决定因素作用.一、概述成骨细胞(Osteoblasts,OB)是骨形成细胞,由基质干细胞起源.破骨细胞(Osteoclasts,OC)则主要负责骨吸收,来源于单核-巨噬细胞系的前体细胞.造血前体细胞在骨营养激素和骨微环境产生的局部因子调节下,在骨吸收部位分化为破骨细胞,对骨的发育、塑形起作用.
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IL-15对MDS CD34+细胞的诱导分化作用探讨
目的观察IL-15对体外培养的MDS CD+34细胞的诱导分化作用,方法应用MACS免疫磁珠分离系统提取高纯度MDS骨髓CD+34细胞,建立以造血生长因子为基础的体外培养体系,用不同浓度的IL-15作用CD+34细胞,流式细胞术检测培养后的细胞单克隆抗体分化和细胞周期的表达,细胞化学染色观察细胞形态变化.结果应用MACS方法成功提取MDS CD+34细胞,体外培养MDS CD+34细胞生长情况一般,IL-15作用后MDS CD+34细胞出现明显分化,细胞形态学显示细胞向成熟转化,实验组的单抗表达水平CD71、CD33、CD19、CD13均较对照组为高,细胞周期分化.结论IL-15对MDS CD+34细胞有一定的诱导分化作用,IL-15对MDS可能有一定的治疗应用前景.
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血清转铁蛋白受体和促红细胞生成素与急性白血病患儿贫血关系的研究
血清转铁蛋白受体(sTfR)是细胞转铁蛋白受体(TfR)的一个可溶性片段,在一定程度上可反映细胞TfR的数量.已有研究表明,TfR在红系细胞、高度增殖细胞(包括肿瘤细胞)和低分化细胞表达较高[1,2].血清促红细胞生成素(sEPO)可以反映体内EPO的生成能力,受骨髓造血前体细胞总量的影响.二者均与红细胞生成密切相关.
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皮肤源性前体细胞在神经再生医学中的应用
皮肤是一种复杂而具有高度再生能力的组织,存在众多不同类型的干细胞,包括表皮干细胞、间充质干细胞、内皮和造血前体细胞以及神经嵴衍生的黑素细胞前体细胞等,这些干细胞可以维持皮肤稳态:包括维持毛囊、皮脂腺的更新,并且保证伤口的愈合及再生.
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骨髓增生异常综合征骨髓活检切片免疫组织化学检测研究近展
骨髓活检切片内免疫组织化学及免疫组织形态学的检测是近年来MDS诊断工作中的一项重要操作技术。使用一组系列特异性或选择性单抗区分出MDS的一些免疫表现型,就可作为对FAB标准分型的补充[1,2],并可从更深层次去寻找早期造血前体细胞病态造血的特点。 目前,骨髓切片内常用的髓性和淋巴性免疫组化标记分析法,对MDS的诊断与鉴别十分重要。例如,使用一组单抗已能检出MDS的一些免疫表现型[1,3]。其中,以髓源性(CD13、CD14、CD15、CD33和CD34)标记物为常用,而真正的原淋巴细胞性(TdT+,CD+19,CD+10)以及双表型模式也已有记载。某些MDS,尤其RAEB等高危患者,病程中可显示干细胞—髓系细胞分化的早期膜表面标记—CD34阳性反应,带有此种CD34表面标记的高危MDS患者易向AML转化[4]。切片免疫酶标技术也有助于病态多形性巨核细胞,尤其是微巨核的识别。此外,MDS患者切片内小梁旁区处于同一发育阶段的幼红细胞簇与淋巴细胞簇的鉴别在常染色上往往有一定困难,这时,使用抗人血红蛋白或抗血型糖蛋白(AGP)A抗体,就可准确鉴别开来[5]。由此可见,切片内的免疫标记显色将显著提高MDS诊断的精确性。 就现阶段而言,优良的骨髓切片免疫组化检测,必须在特殊处理过的塑料包埋标本上进行。而此项技术在国内、外许多实验室中尚无法普及。随着真空—冷包埋、简易冷丙酮固定之GMA包埋、微波热处理技术以及甲基丙稀酸酯(MMA)包埋技术的推广[5,6],外加切片免疫酶标显色再结合其他组织学技术的联合,就能更进一步提高MDS潜在阳性标记物的识别。目前常用的联合技术包括[2]: (1)切片免疫酶标显色与氯醋酸酯酶(Leder染色)或萘酚—酯酸酯酶等组化技术的联合。 (2)使用两种不同偶氮染料,经由APAAP免疫酶标方法,测试两种不同单抗的连续双标记免疫标记检测。 (3)切片免疫酶标染色与免疫形态学测量的联合。 (4)免疫显色与原位荧光杂交(FISH)的联合,此种检测能为察觉先前免疫标记间期细胞中的细胞遗传学异常。
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正常核型急性髓系白血病患者BAALC基因的表达和临床意义
BAALC(脑和急性髓系白血病·胞质)基因定位于染色体8q22.3,其DNA序列和表达在哺乳动物中高度保守,主要表达在神经外胚层来源的组织及造血前体细胞中,成熟的骨髓和外周血单个核细胞不表达,编码的蛋白不与任何已知的蛋白或功能域同源,其功能尚不清楚.
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核型异常骨髓增生异常综合征-难治性贫血的细胞形态学特点
骨髓增生异常综合征(MDS)是造血前体细胞的恶性克隆性疾病,实质为血液细胞的病态造血及无效造血而导致外周血一系、两系或三系血细胞减少,出现贫血、出血或感染等临床表现.
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免疫活性细胞对骨代谢的调控作用
1 骨免疫学的概念骨形成和骨吸收之间的平衡调节着骨内环境稳定,这包括有成骨细胞(Osteoblasts,OB)和破骨细胞(Osteoclasts,OC)间相互的协调作用.OB是骨形成细胞,可分泌骨基质分子;而来源于造血前体细胞的OC则吸收骨基质.
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IL-15联合其他细胞因子对MDS患者CD34+细胞体外增殖、分化的影响
为了探讨IL-15与其他细胞因子联合应用对体外培养的MDS患者CD34+细胞增殖和分化的影响.应用单克隆抗体(mAb)免疫磁珠系统分离CD34+细胞,实验分为IL-15加其他细胞因子的实验组和不加其他细胞因子的单独应用IL-15的对照组,用液体培养基和甲基纤维素半固体培养基培养,计数培养后细胞数和CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM的集落形成数.用流式细胞术检测上述培养细胞上各种表型分子CD33、CD13、CD71、CD19、CD3表达的变化和细胞周期的改变.结果显示IL-15与其他细胞因子联合应用的实验组作用于MDS患者CD34+细胞,培养6 d的细胞计数显示,细胞增殖倍数对照组为4.0倍,实验组为7.8倍;各祖细胞集落形成率实验组均明显多于对照组;培养细胞上各表型分子(CD3除外)的表达率实验组均明显高于对照组;IL-15加其他细胞因子联合应用后CD34+细胞的细胞周期G1、S、G2期的比率均有明显变化,与对照组相比较,差异显著.IL-15与其他细胞因子联合应用比单独应用IL-15对MDS患者CD34+细胞有明显地促增殖和诱导分化的效应.
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脐血干细胞移植在儿童疾病中的应用前景
骨髓造血干细胞移植(BMT)是近年来各国应用较为广泛的医治血液系统疾病的方法.BMT可分为自体和异体造血干细胞移植两种,由于种种原因均开展得很局限.一般无血缘关系的人群中,HLA配型一致的机率是1~2万分之一,再加之对骨髓移植的偏见使多数人不愿接受HLA配型检测,因此,干细胞的来源成为干细胞移植的一大难题. 脐血干细胞(umbilical cord blood stem cell,UCBC),取自来源广泛的脐血,富含CD34+细胞.CD34+细胞是具多系分化潜能的造血前体细胞,可能与细胞与细胞间的粘附及造血相关基因的表达有关.随胎龄增长,CD34+细胞表达比例显著下降,妊娠13周时CD34+细胞占11.1%,足月时仅占1.0%.所需造血干细胞低数量随供体与受体间HLA相容性、病人抗HLA敏感性及年龄等因素而变化.人脐血CD34+ Thy+Lin-细胞被当作原始的干细胞,每104个低密度单核细胞(LDMNC)中有一个干细胞.脐血中还包括早期和定向造血祖细胞,是成人外周血10倍,含CFU-GM(粒单系集落形成单位)、BFU-E(红系爆式集落形成单位)、CFU-L(淋巴系集落形成单位)、CFU-Meg(巨核系集落形成单位)和CFU-Mix(混合系集落形成单位).BMT时重建体内造血所需造血干细胞数量尚未确定.成人同种异基因骨髓移植少需CD34+细胞≥2×105/kg,而1份脐血通常含(20~50)×104个干细胞.粒单集落形成细胞(GM-CFCs)为(1~10)×103/kg,而脐血GM-CFCs在(2~2.5)×106.每例脐血采集量约50ml~200ml,就可移植成功1个50kg体重的成人,因此1份脐血对于1名一般儿童已经足够.
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造血细胞工程--一个新兴的研究与应用领域
近年来,造血细胞分选技术、造血生长因子的发现与克隆、各种ex vivo操作技术的建立与完善,使得造血细胞在数量、性能和功能方面的改造更易于操作与应用,从而产生了一个新兴的研究与应用领域,即造血细胞工程.造血细胞工程是利用造血干/ 祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能,通过细胞工程的技术,在体外模拟或部分模拟体内的造血过程(包括基质细胞的支持和造血生长因子的调控等),对分离纯化的造血干/ 祖细胞进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等,从而在短时间内大量扩增早期造血祖细胞及各阶段的造血前体细胞,以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/ 巨噬细胞、巨核细胞/ 血小板、树突状细胞( Dendritic cells,DC)、NK细胞、T/ B淋巴细胞等功能血细胞和免疫活性细胞,并可对部分细胞的功能进行激活和调控,对缺陷性基因进行靶向性转染,终将造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域.
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白细胞介素-15对骨髓增生异常综合征骨髓造血干/祖细胞增殖的影响
目的:观察白细胞介素(IL-15)对体外培养的骨髓增生异常综合征(MDS)患者CD34+细胞增殖作用.方法:应用单克隆抗体免疫磁珠分离系统提取MDS患者CD34+细胞,以加IL-15组为实验组,不加IL-15组为对照组,进行液体和甲基纤维素半固体集落培养,计算培养后细胞数和CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFUGEMM等集落数,并用MTT比色法检测IL-15对MDS患者CD34+细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测上述培养细胞周期的变异情况.结果:11例MDS对象平均CD34+细胞比例、回收率、纯度和富集倍数均达要求,MTT比色法检测IL-15对CD34+细胞的增殖作用呈佳浓度效应,佳浓度为20μg/L,细胞增殖抑制低峰值时间为8 d.用0μg/L IL-15(对照组)和20μg/L IL-15(实验组)作用MDS CD34+细胞,计数显示培养细胞大增殖倍数和集落形成比率实验组均较对照组明显增加,IL-15作用后各细胞周期G1、S、G2期比例有明显改变,与对照组比较,差异有统计学意义.结论:IL-15对MDS CD34+细胞有促增殖效应,与其它造血生长因子具有协同作用,对MDS治疗可能有一定的应用前景.
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成骨细胞促进胚胎干细胞向造血前体细胞分化的研究
目的 观察成骨细胞对胚胎干细胞(ESC)向造血前体细胞分化的促进作用.方法 用平皿黏附法培养BALB/c小鼠骨髓基质细胞,诱导分化为成骨细胞,鉴定后用作支持细胞.将小鼠胚胎于细胞(ESC-D3)先诱导生成胚胎体(EB),再与成骨细胞共培养,3d后进行代表血液血管干细胞的原始细胞集落(BL-CFC)培养并计数;7d后行流式细胞仪检测ESC来源的CD34+细胞生成比例.结果 在成骨细胞的支持下,与空白对照比较,ESC来源的代表血液血管干细胞的BL-CFC集落增加了2.89倍;由ESC生成的CD34+细胞由(12.68±2.39)%增加到(32.83±3.84)%.结论 成骨细胞体外可促进胚胎干细胞向造血前体细胞分化.
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低温冷冻对脐血CD+34细胞和造血祖细胞增殖的影响
采用-80℃低温冷冻法,观察冷冻前及冷冻后1、2、3周时单个核细胞(MNC)的回收率,脐血造血前体细胞在体外的增殖力,并用流式细胞仪检测CD+34细胞的百分率。旨在探讨低温冷冻对脐血造血前体细胞的影响。结果表明:脐血冷冻后1、2、3周时MNC的回收率分别为93.6%,91.5%和90.7%(P>0.05);细胞活力分别为98%,97%,95%和91%(P>0.05);CD+34细胞依次为1.20%、1.18%、1.16%和1.17%;CFU-GM,CFU-E冷冻后1、2周时回收率达97%和95%(P>0.05),第3周时达89%(P>0.05)。结果提示:长期冷冻可能导致冷冻之脐血祖细胞产率下降,但对代表造血干细胞的CD+34细胞影响则不大。
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胎肝造血前体细胞特征及其临床应用的研究进展
肝脏是胎儿时期的主要造血器官,鼠胚胎12~15 d[1,2]和人胚胎6周至4月是肝脏造血活跃期.在个体发育阶段上,胎肝造血干细胞(HSCs)较骨髓造血干细胞原始;从生理需求角度讲,骨髓HSCs的功能是维持终生造血稳定,其分裂采取群体不对称方式,因此骨髓HSCs数目在人体内保持恒定.而胎肝造血是处于由胚胎造血系统分化形成转向为胎儿日益扩张的循环容量和氧需提供足够红细胞的过渡时期,因此,胎肝HSCs有一个对称分裂以增加自身数目的性能和过程,以便为终生造血稳定提供足够的干细胞贮备[1,3,4].因此可以推测,胎肝造血前体细胞在增殖潜力、多系分化和自我更新能力方面应该比骨髓相应细胞更具优势.本文就近年有关胎肝造血前体细胞生物学特征及其临床应用方面的进展作一综述.
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增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸调节脐血CD34+造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应
目的:探讨低浓度增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸(PCNA-ASODN)调节脐血造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应.方法:用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离出CD34+细胞,先后加入低浓度PCNA-ASODN作用于体外培养的CD34+细胞,用流式细胞仪检测培养后各种细胞的数量及细胞周期的变化.结果:实验组脐血CD34+造血前体细胞明显被扩增,但以第72h组的扩增效应为显著,其CD34+细胞比例增高[(35.6±1.8)%],而CD34+CD38-细胞数量扩增达(55.1±4.2)倍,且G0/G1期细胞占(49.8±2.5)%.结论:低浓度PCNA-ASODN对脐血CD34+造血前体细胞体外扩增的调节具有时间效应,同时能延缓扩增过程中伴随的细胞分化.
关键词: 增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸 造血前体细胞 体外扩增 -
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在创面愈合中的应用进展
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)是近几十年来医学研究的一热门细胞因子.1977年它由Burgess等在鼠的肺条件培养液中首次发现,因能刺激造血前体细胞形成粒细胞巨噬细胞集落,故而得名[1].1985年,人类GM-CSF基因(human GM-CSF,hGM-CSF)被首次克隆表达,此后重组人GM-CSF(recombinant human GM-CSF,rhGM-CSF)渐应用于临床.
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两种人胚胎干细胞体外诱导C D34+造血前体细胞方法的比较
目的:对比小鼠骨髓基质细胞系OP9共培养和二维单层诱导方法体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)产生CD34+造血前体细胞的效率,为后续研究提供参考。方法采用hESCs与OP9共培养方法或用二维单层诱导方法诱导hESCs产生CD34+造血前体细胞,通过流式细胞仪检测分化效率,比较两种方法的效果。结果通过hESCs/OP9共培养方法,hESCs在分化第9日出现CD34+细胞,比例达(19.7±7.9)%;通过二维单层诱导方法,hESCs在分化第6日即出现CD34+细胞,比例仅为(5.8±1.8)%,两种方法分化效率比较差异具统计学意义(P<0.05)。结论 hESCs/OP9共培养方法和二维单层诱导方法均可将hESCs诱导为造血前体细胞,相对于二维单层诱导方法,hESCs/OP9共培养方法尽管需要更长的时间,但其分化效率更高,更有利于后续研究。