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YC－1对低氧诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖和P53表达的影响
目的：研究低氧诱导因子（HIF－1α）抑制剂3－（5’－羟甲基－2’－呋喃基）－1－苯甲基吲唑（YC－1）对低氧诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖、凋亡以及P53表达的影响，并探讨其相关分子机制。方法体外培养人肺动脉平滑肌细胞（HPASMCs），将细胞分为常氧组、低氧组及低氧＋YC－1（0．01和0．05mmol／L）组；用CCK－8法及流式细胞仪检测细胞的增殖与凋亡，Western－blot法检测HIF－1α和P53蛋白的表达，RT－PCR检测P53 mRNA的表达。结果低氧能够促进HPASMCs的增殖；不同浓度的YC－1处理24 h后，HPASMCs增殖率显著下降（P＜0．05），凋亡率显著升高（P＜0．05）；YC－1能降低HIF－1α蛋白的表达，上调P53的表达（P＜0．05）。结论 YC－1能抑制低氧诱导HPASMCs增殖，促进细胞凋亡，其作用机制可能与上调P53表达有关。
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黏着斑激酶在人肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用机制探讨
研究表明,黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)参与了多样细胞黏附、扩散、迁延、存活、生长等过程[1].然而,FAK是否参与了人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)增生报道尚较少.本组研究采用人FAK反义寡核苷酸(ODNs)选择性抑制FAK蛋白表达的方法,旨在探讨FAK是否参与了HPASMCs的增生.
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缺氧促进人肺动脉平滑肌细胞黏着斑激酶表达
黏着斑激酶(FAK)与人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)增殖有关[1].FAK是否参与了缺氧状态下HPASMC的增殖尚少报道.我们的研究对此进行了缺氧情况下FAK在HPASMC增殖中的作用.
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生存素抑制缺氧性人肺动脉平滑肌细胞线粒体凋亡机制初探
在缺氧性肺动脉高压（ hypoxic pulmonary hypertension ， HPH）发生发展过程中，肺动脉平滑肌细胞（ pulmonary arterial smooth muscle cells ，PASMCs）过度增殖，凋亡受抑制。目前的研究结果表明，在缺氧条件下PASMCs线粒体膜电位升高，导致线粒体膜的通透性降低，抑制线粒体细胞色素C的释放及Caspase的级联反应，线粒体依赖的凋亡途径受到抑制［1］。生存素在凋亡抑制蛋白（ inhibitor of apoptosis proteins， IAP）家族中效应强，参与调控生命周期的2个基本过程，即抑制凋亡和促进细胞增殖［2］。我们前期的研究结果表明生存素在常氧（21％O2）培养的人肺动脉平滑肌细胞（ human pulmonary arterial smooth muscle cells ， HPASMCs ）中不表达，而在缺氧（2.5％O2）培养的HPASMCs中表达，并且促进HPASMCs 增殖，抑制其凋亡［3］。但生存素抑制缺氧HPAMSCs凋亡的机制目前仍不清楚，本研究旨在探讨生存素抑制缺氧HPAMSCs凋亡的机制，为探索预防和治疗缺氧肺动脉高压提供实验基础。
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西地那非抑制内皮素-1诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖机制
动脉型肺动脉高压(pulmonary artery hypertension,PAH)主要病理生理变化是肺血管异常收缩、肺血管重构,肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖显著是肺血管重构的重要表现之一,细胞内Ca~(2+)是细胞增殖的分子基础,钙库操控性通道(SOC)是调节细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i)的重要途径.TRPC1属于瞬时性感受器电位(transient receptor potential,TRP)家族蛋白,参与构成SOC并在人PASMCs中表达丰富.
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西地那非抑制低氧对人肺动脉平滑肌细胞电压依赖性钾通道的下调作用
目的 探讨西地那非对低氧下调人肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASM Cs)电压依赖性钾通道(voltage-dependent potassium channels,Kv)的干预作用.方法 应用膜片钳技术记录PASMCs K+电流；观察低氧刺激前后钾离子(K+)电流的变化以及西地那非(sildenafil)的干预作用；通过特异性Kv1.5抗体透析,分析西地那非作用于人PASMCs Kv分子靶点即通道亚单位；运用Real-time PCR及Western blotting技术检测低氧刺激前后及西地那非对人PASMCs上的Kv1.5通道基因转录水平和蛋白表达水平的影响.结果 低氧明显抑制了人PASMCs细胞膜上的全细胞K+电流；而西地那非则可以对抗低氧对全细胞K+电流的抑制作用；而且西地那非对低氧下人PASMCs Kv的调控作用靶点主要是Kv1.5；同时西地那非部分恢复了低氧抑制的细胞上的Kv1.5 mRNA和蛋白表达.结论 西地那非能够抑制低氧对人肺动脉平滑肌细胞电压依赖性钾通道功能与表达的下调作用.
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缺氧对人肺动脉平滑肌细胞双孔钾通道TASK-1影响及非受体酪氨酸激酶的调节作用
目的:探讨缺氧对人肺动脉平滑肌细胞内向整流酸敏感性双孔钾通道(TASK-1)的影响,及非受体酪氨酸激酶(c-Src)对该过程的调节作用.方法:培养人肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs):分为正常组、缺氧30 min组、缺氧6h组、缺氧48h组及缺氧48 h+ PP2组、缺氧48 h+PP3组和缺氧48 h+bpV组,应用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR及Western blot方法测定不同组细胞TASK-1的mRNA及蛋白表达变化.结果:①细胞周期显示:与正常对照组相比,随缺氧时间延长,S期百分率增加;与缺氧48h组相比,缺氧48 h+ PP2组S期百分率下降;②急性缺氧6h组TASK-1 mRNA表达增加,慢性缺氧组TASK-1 mRNA表达降低,急、慢性缺氧组TASK-1蛋白表达减少;c-Src抑制剂PP2可促进TASK-l mRNA及蛋白表达,酪氨酸磷酯酶抑制剂bpV抑制TASK-1蛋白表达.结论:缺氧促进人肺动脉平滑肌细胞增殖,非受体酪氨酸激酶c-Src介导急、慢性缺氧对双孔钾通道TASK-1调控过程,可能与缺氧性人肺血管收缩存在一定的相关性.
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新型KATP开放剂埃他卡林对原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1、PCNA mRNA表达的影响
目的 观察新型ATP敏感性钾(KAPT)开放剂埃他卡林(IPT)对原代培养人肺动脉平滑肌细胞转化生长因子β1(TGF-β1)和增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA表达的影响.方法 分离3～4级人肺小动脉,按照组织贴块法原代培养人肺动脉平滑肌细胞,用内皮素1(ET-1)诱导细胞增殖,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RQ-RT-PCR)技术检测TGF-β1和PCNA目的 mRNA表达变化.结果 ET-1(10 nmol/L)诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖的同时,TGF-β1、PCNA mRNA 表达均增加;在相同条件下,加入ET-1(10 nmol/L)的同时,分别在培养基中加入IPT 10-7、10-6、10-5 mol/L 作用 24 h 后,IPT呈浓度依赖性地抑制TGF-β1、PCNA mRNA表达;加入ET-1(10 nmol/L)、IPT(10-5 mol/L)前30 min,预先加入特异性KATP拮抗剂格列本(Glibenclimide,GLI)10-7、10-6、10-5 mol/L,GLI呈浓度依赖性地拮抗IPT的抑制作用.结论 IPT通过开放KATP通道,浓度依赖性地抑制原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1、PCNA mRNA表达,抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖,有望今后成为治疗缺氧性肺动脉高压(HPH)、肺血管重构的药物.
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人肺动脉平滑肌细胞中精氨酸酶Ⅱ与微小RNA-17的相互作用
背景：已有研究证实 microRNA-17-92簇在肺动脉高压中发挥着重要作用，精氨酸酶Ⅱ又参与低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的增殖，而人肺动脉平滑肌细胞中微小 RNA-17与精氨酸酶Ⅱ之间的相互作用尚未见研究报道。
目的：分析人肺动脉平滑肌细胞中，微小RNA-17与精氨酸酶Ⅱ的关系及其相互作用机制。
方法：选用4-8代的人肺动脉平滑肌细胞，分别给予转染微小RNA-17的抑制剂、增强剂、精氨酸酶Ⅱ小干扰RNA等处理，分别在常氧(体积分数21%O 2)及低氧(体积分数1%O 2)条件下培养。提取RNA和微小RNA，采用实时定量PCR法检测各组平滑肌细胞中微小RNA-17和精氨酸酶ⅡmRNA的表达，提取蛋白，采用Western blot法比较各组细胞中精氨酸酶Ⅱ等蛋白水平的表达。
结果与结论：低氧下人肺动脉平滑肌细胞中微小RNA-17及精氨酸酶Ⅱ的表达均明显增加，抑制微小RNA-17的表达可阻止低氧诱导的精氨酸酶Ⅱ的表达增加，微小 RNA-17的过表达可使精氨酸酶Ⅱ表达上调，精氨酸酶Ⅱ基因敲除后，低氧诱导的微小 RNA-17的表达受到抑制。提示人肺动脉平滑肌细胞中，精氨酸酶Ⅱ是微小RNA-17的一个新的靶基因，而且精氨酸酶Ⅱ可以反馈调节微小RNA-17的表达。 -
KATP通道与人肺动脉平滑肌细胞外信号调节激酶磷酸化的关系
目的 研究三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾(KATP)通道与人肺动脉平滑肌细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)磷酸化的关系.方法 原代培养人肺动脉平滑肌细胞,用Western-blot方法 检测磷酸化细胞外信号调节激酶1和2(p-ERK1/2).对照组不予干预,实验组分别加入内皮素-1(ET-1)、ET-1+埃他卡林、吡那地尔或格列本脲等孵育.结果 ①在2～30 min,ET-1呈时间依赖性促进人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化,10 min时明显.②埃他卡林和吡那地尔可拮抗ET-1对ERK1/2磷酸化的影响.③特异性KATP通道阻断剂格列本脲可逆转埃他卡林和吡那地尔的作用.结论 KATP通道开放剂可能通过激活KATP通道,抑制ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞ERK1/2磷酸化,KATP通道可能是研发新型治疗肺动脉高压药物的重要靶分子.
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新型KATP开放剂iptakalim对人肺动脉平滑肌KATP通道 mRNA表达的影响
目的 研究新型KATP开放剂iptakalim对原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道亚基SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响,以探讨iptakalim治疗肺动脉高压的分子生物学机制. 方法 分离人手术标本正常肺组织3~4级肺小动脉,原代培养人肺动脉平滑肌细胞.正常组不予干预,试验组分别加入内皮素-1(ET-1)、ET-1+不同浓度iptakalim或Glyburide等孵育24 h.以Trizol法抽提总RNA,逆转录为cDNA,以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RQ-RT-PCR)法检测各组细胞KATP通道 mRNA表达量. 结果 ET-1组SUR2B mRNA的表达量较正常组明显减少.iptakalim呈浓度依赖性拮抗ET-1作用,提高SUR2B mRNA表达量.Glyburide呈浓度依赖性拮抗iptakalim作用,减少SUR2B mRNA表达量.各组Kir6.1 mRNA表达量无统计学差异. 结论 新型KATP开放剂iptakalim呈浓度依赖性增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道mRNA表达量,可能成为较有前途治疗肺动脉高压的有效药物.
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埃他卡林对原代培养人肺动脉平滑肌细胞转化生长因子β1 mRNA表达的影响
目的 研究新型 ATP敏感性钾(KATP)开放剂埃他卡林(IPT)对缺氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA表达的影响.方法 分离 3～4 级人肺小动脉,按照组织贴块法原代培养人肺动脉平滑肌细胞,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RQ-RT-PCR)技术检测细胞 TGF-β1 mRNA表达情况.结果 缺氧使原代培养人肺动脉平滑肌细胞TGF-β1 mRNA表达增加;相同条件下,在缺氧的同时,分别在培养基中加入 IPT 10-7、10-6、10-5 mol· L-1,IPT呈浓度依赖性地抑制细胞 TGF-β1 mRNA表达;加入 IPT 10-5 mol· L-1前 30 min,预先加入格列本脲(GLI)10-7、10-6、10-5 mol· L-1,GLI呈浓度依赖性地拮抗 IPT的作用.结论 IPT通过激活细胞 KATP通道,浓度依赖性地抑制缺氧诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞 TGF-β1 mRNA表达增加.
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Iptakalim对低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖及TGF-β和PCNA表达的影响
目的 研究新型ATP 敏感性钾通道(KATP) 开放剂Iptakalim(IPT)对低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)增殖及转化生长因子-β(TGF-β)和核增殖抗原(PCNA)表达的影响.方法 原代培养HPASMC,随机分成对照组、低氧组、低氧+IPT 10-7组、低氧+IPT 10-6组和低氧+IPT 10-5组,采用流式细胞技术检测细胞周期,用细胞免疫组织化学技术检测细胞TGF-β和PCNA表达部位分布,用Western-blot方法检测TGF-β和PCNA蛋白的表达量.结果 缺氧24 h,G0/G1期细胞比例减少,S期比例增高,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学技术显示TGF-β染色主要位于细胞浆和细胞膜,PCNA染色主要位于细胞核;Western-blot结果显示低氧组TGF-β和PCNA的表达高于对照组(P<0.05)和低氧+IPT组(P<0.05),随着IPT剂量的增加,TGF-β和PCNA的表达呈下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 低氧能诱导原代培养的HPASMC增殖,刺激TGF-β和PCNA表达增高;IPT能浓度依赖性抑制这种作用,其机制可能与抑制TGF-β和PCNA的表达有关.
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吡那地尔对人肺动脉平滑肌细胞KATP通道mRNA表达的影响
目的:研究经典KATP开放剂吡那地尔对原代培养人肺动脉平滑肌细胞 KATP 通道mRNA表达的影响,以探讨KATP通道在肺动脉高压发生发展中的分子生物学机制.方法:分离人3～4级肺小动脉,原代培养人肺动脉平滑肌细胞.分成ET-1组、ET-1+吡那地尔组及ET-1+吡那地尔+格列本脲组.以Trizol法抽提总RNA,逆转录为cDNA,采用Real-time PCR方法检测各组细胞KATP通道SUR2B和Kir亚单位mRNA表达量.结果:ET-1 组 KATP通道SUR2B mRNA表达量较对照组明显减少,为对照组的0.09±0.01倍(P<0.05,n=3).加用吡那地尔可拮抗ET-1作用,提高SUR2B mRNA表达量,为ET-1组的10.94±1.13倍,为对照组的0.97±0.03倍(P>0.05,n=3).格列本脲可拈抗吡那地尔作用,减少SUR2B mRNA表达量,为ET-1+吡那地尔组的0.10±0.01倍,为对照组的0.07±0.02倍(P<0.05,n=3).各组细胞KATP通道 Kir6.1 mRNA 表达量无统计学差异.结论:KATP 开放剂吡那地尔可增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道SUR2B mRNA表达量,这可能是其调节肺动脉平滑肌细胞KATP通道表达和功能的机制.
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新型KATP开放剂埃他卡林对原代培养人肺动脉平滑肌细胞PCNAmRNA表达的影响
目的:观察新型ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂埃他卡林(IPT)对原代培养人肺动脉平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA表达的影响.方法:分离3～4级人肺小动脉,按照组织贴块法原代培养人肺动脉平滑肌细胞,分成对照组、缺氧组、缺氧+埃他卡林或吡那地尔组及缺氧+埃他卡林或吡那地尔+格列本脲组,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RTPCR)技术检测细胞PCNA mRNA表达.结果:缺氧使人肺动脉平滑肌细胞PCNA mRNA表达增加(3.90+0.24)倍,与对照组比较差异有显著性(P＜0.01);相同条件下,在缺氧的同时,分别在培养液中加入IPT 10-7、10-6、10-5mol/L,PCNA mRNA表达分别下降(26.00±2.01)%、(55.33±4.04)%、(79.00±1.00)%,与缺氧组比较差异均有显著性(P均＜0.01);加入IPT 10-5mol/L前30 min,预先加入格列本脲(GLI)10-5 mol/L,IPT的抑制作用抵消,与缺氧+IPT 10-5 mol/L组比较差异有显著性(P＜0.01).结论:IPT通过激活细胞KATP通道,浓度依赖性地抑制缺氧时原代培养人肺动脉平滑肌细胞PCNA mRNA表达的增加.
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吡那地尔对人肺动脉平滑肌细胞KATP通道蛋白及ERK1/2磷酸化的影响
目的 探讨ATP敏感性钾(KA口)通道开放剂吡那地尔(Pin)对内皮素1(ET-1)诱导的人肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)KATe通道蛋白表达及细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)磷酸化的影响.方法 体外培养人PASMCs,用ET-1诱导其增殖,应用Westem blot方法评价Pin对ET-1诱导的人PASMCs KArP通道蛋白磺酰脲受体亚单位(SUR2B)和内向整流性孔区亚单位(Kir6.1)表达的影响以及ERK1/2的磷酸化作用.结果 ET-1显著下调SUR2B的表达,Pin呈浓度依赖性上调SUR2B表达；KATP通道拮抗剂格列本脲阻断Pin的作用,而Kir6.1的表达不受影响.ET-1呈时间依赖性促进人PASMCs ERK1/2磷酸化,10min时明显,Pin(10μmol/L)拮抗ET-1对ERK1/2磷酸化的影响,格列本脲逆转Pin的作用.结论 KATP通道开放剂Pin通过上调KATP通道蛋白的表达,抑制ET-1诱导的人PASMCs ERK1/2的磷酸化.
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骨形成蛋白-2对低氧状态下的人肺动脉平滑肌细胞PTEN表达的作用
目的:研究骨形成蛋白-2(BMP-2)对低氧状态下人肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的PTEN(Phosohatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)表达调节作用.方法:将培养的人PASMCSs分为对照组(1%的氧浓度,5%的CO2和94%N2条件下培养)和BMP-2组(另加入BMP-2),培养48 h后通过CyQUANT细胞增殖检测试剂盒测定PASMCs的增殖,定量RT-PCR方法检测PTEN基因表达,Western blot方法检测PTEN蛋白的表达.结果:BMP-2组与对照组比较细胞增殖明显降低(P<0.05);定量RT-PCR结果显示,与对照组比较,BMP-2组细胞培养4 h、8 h、24 h后PTEN相对表达量(2<'-ΔΔct>)均明显升高(P<0.05);进一步的western blot证实BMP-2组PTEN蛋白表达也明显升高.结论:BMP-2能抑制缺氧状态下的PASMCs的增殖,通过上调PTEN表达可能是其机制之一.
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1 -磷脂酰肌醇3-激酶在低氧人肺动脉平滑肌细胞增殖中的表达
目的探讨1-磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3'-kinase,PI3K)在低氧引起的人肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用.方法采用细胞培养方法,免疫印迹技术,流式细胞仪方法测定了在低氧情况下PI3K的表达及其细胞周期的变化.结果低氧情况下细胞中P13K的表达增加,细胞呈现增殖性变化.结论P13K在低氧情况下参与了人肺动脉平滑肌细胞增殖,具有重要的病理生理学意义.
关键词： 低氧 1-磷脂酰肌醇3-激酶 人肺动脉平滑肌细胞 增殖 -
siRNA反向转染人肺动脉平滑肌细胞的条件优化
目的 寻找小分子干扰RNA转染人肺动脉平滑肌细胞的的佳条件,建立有效的转染体系.方法 采用化学合成的能够抑制管家基因表达的siRNA,以0,5,10,15,30nmol/L的siRNA浓度,应用脂质体Lipofacet-amine RNAi MAX转染人肺动脉平滑肌细胞,转染48小时后通过显微镜观察和CCK-8检测细胞的增殖情况,评估转染效率.结果 对照组细胞生长正常,在不同转染浓度下,细胞的生长情况受到不同程度的影响.试剂对照组与空白对照组(0nmol/L组)细胞增殖无差异(P＞0.05),10nmol/L以上浓度组的转染效率显著高于5nmol/L组(P＜0.05),10、15和30nmol/L组转染效率差异不显著(P＞0.05).结论 化学合成的siRNA可以在10nmol/L的浓度即可获得理想的转染效果.
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曲格列酮对低氧状态下肺动脉平滑肌细胞的作用机制研究
目的 探讨曲格列酮对低氧状态下肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的作用机制.方法 人PASMCs在37℃5％CO2+94％N2+1％O2条件下分别加入20μmol/L的曲格列酮培养72 h.通过聚合酶链反应(PCR)法测定PASMCs内PTEN、Caspase-3和Caspase-8基因表达;Western blot法测定PTEN,p-Akt,Akt蛋白的表达.结果 曲格列酮抑制低氧条件下PASMCs的增殖;曲格列酮组PASMCs PTEN mRNA和蛋白表达水平升高,曲格列酮增加了PASMCs的Caspase-3及Caspase-8活性;PTEN抑制剂bpV(HOpic)和PPARγ抑制剂GW9662可通过下调PTEN基因表达而逆转曲格列酮对PASMCs的增殖抑制作用.结论 曲格列酮可增强PTEN的表达,促进低氧条件下PASMCs的凋亡,同时通过PPARγ途径增强PTEN表达.
