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促甲状腺激素受体抗体的检测方法
1 促甲状腺激素受体抗体(TRAb)概况及临床意义1. 1 TRAb概况 TRAb是人类特有的一种直接抗促甲状腺激素受体(TSHR)的自身抗体,也是一种由不同B淋巴细胞产生的不均一性的多克隆抗体.根据其生物学活性不同,分为兴奋性抗体(刺激性抗体)与抑制性抗体(阻断性抗体).兴奋性抗体包括:①甲状腺刺激抗体(TSAb),又称甲状腺刺激免疫球蛋白(TSI),能与促甲状腺激素(TSH)受体结合引起甲状腺功能亢进;②甲状腺生长刺激免疫球蛋白(TGI),它能识别TSH受体,刺激甲状腺细胞生长、增殖,使甲状腺肿大.
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双特异性抗体治疗卵巢癌的研究进展
卵巢癌的生物治疗,包括细胞因子、单克隆抗体、转基因治疗等多种方式.基于单克隆抗体IgG的结晶片段(Fc)用于肿瘤的治疗中,除了和NK细胞、巨噬细胞结合外,因其同时和非细胞毒作用的细胞如血小板、B淋巴细胞、粒细胞等带有Fc受体的细胞结合,在治疗中受到部分限制.近年来,多种类型的双特异性抗体(BsAb)用于肿瘤的实验及临床研究.早的BsAb出现在1961年,是将两种不同特异性的多克隆抗体的抗原结合片断(Fab)混合经过温和氧化而制备的,在体内和体外分别能与两种特异抗原结合产生生物学效应.现可通过化学偶联法、细胞工程法、基因工程法制备多种类型的BsAb,在肿瘤药物导向治疗、免疫学检测和介导细胞毒作用中广泛应用,在卵巢癌的生物治疗应用亦越来越普遍.
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辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的表达与多克隆抗体制备
目的:制备辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)多克隆抗体.方法:应用大肠杆菌BL21-AI表达NRDR,制备NRDR包涵体,使用从SDS-PAGE凝胶中回收的重组NRDR作为免疫原,采用肩胛骨下注射作为免疫途径免疫兔.斑点杂交测定抗血清效价,HiTrap Protein G柱纯化兔IgG,免疫印迹鉴定抗体特异性.结果:BL21-AI对NRDR进行了高效表达.回收的NRDR蛋白溶液的浓度为0.36mg/ml,回收率为48.5%.所有免疫的动物在第2次追加免疫之后都产生了高效价的抗血清,血清的效价是1:500,检测极限是8ng NRDR蛋白.纯化后的NRDR抗体具有较高的免疫活性和特异性.结论:建立了高效制备辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶多克隆抗体的方法.
关键词： 辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶 基因表达 多克隆抗体 免疫 -
癌症放射免疫治疗
将具有细胞毒性的放射性同位素(RI)标记的抗肿瘤抗体应用给荷瘤患者,可得到癌瘤特异性放射治疗,即放射免疫治疗(Radioimmunotherapy,RIT),在理论上它是非常有前途的治疗方法.本法始于1950年代,初是用多克隆抗体进行,不过从Kohler和Milstein(1975年)确立杂交瘤技术后,因可较容易获得高纯度的抗肿瘤单克隆抗体,使RIT的研究发生了飞跃性进步.
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重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定
目的:构建人神经肽Y (NPY)基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清.方法:取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a - NPY转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2 - NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a - NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果:经IPTG诱导含有pET28a - NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白.重组蛋白经Ni2+ - NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论:成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础.
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81例女性淋病患者孔蛋白基因型分布及与相应多克隆抗体的反应特性
目的:采用PCR和探针技术分析临床淋病奈瑟菌野生株孔蛋白基因的基因型,并和相应多克隆抗体进行反应以检测基因突变对抗原性的影响.方法:采用PCR技术从淋病奈瑟菌野生株中扩增出特征性的孔蛋白基因片段,再用探针检测相应的高变区情况,以区分不同的准种(亚型),后分别与原核表达的标准菌株孔蛋白多克隆抗体进行反应,观察相应的滴度.结果:孔蛋白基因型为A型的有35例,其余46例为B型.孔蛋白A型基因型变化较小,与抗体的反应性较一致;孔蛋白B型基因型变化稍大,但不影响与多克隆抗体的反应活性,A型与B型存在交叉反应,但活性较低,滴度＜1:40.结论:通过分析不同孔蛋白基因型淋病奈瑟菌与相应多克隆抗体的反应情况,有助于考察孔蛋白原核表达产物的生物学效应,对于人工合成出能针对绝大多数临床基因变异菌株的探针用于检测或治疗性抗体的制备有重要意义.
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小分子化合物多克隆抗体纯化方法优化及比较研究
目的 比较多克隆抗体的纯化方法,探讨多克隆抗体纯化的优化方案.方法 以丙烯酰胺多克隆抗体为纯化对象,进行抗体浓度、识别特征、亲和常数等对比研究,比较盐析(辛酸-饱和硫酸铵法)、蛋白G亲和纯化、载体蛋白亲和纯化、全抗原亲和纯化4种抗体纯化方法对于小分子多克隆抗体的纯化效果.结果 采用的4种方法对于多克隆抗体的纯化效果有一定差异,蛋白G亲和纯化与载体蛋白纯化联合使用的纯化效果较为理想,获得的抗体纯度高、单一识别小分子抗原,且具有佳的亲和常数.结论 通过本文研究,优化的蛋白G亲和纯化与载体蛋白纯化的组合方案提高了多克隆抗体质量,为后续免疫分析方法研究提供技术基础.
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Golph2蛋白质的原核表达及多克隆抗体制备
目的:新近发现Golph2蛋白与肝癌关系密切,制备Golph2重组蛋白质和多克隆抗体,建立Western blot检测技术,为后续研究提供基础.方法:RT-PCR从人肝癌细胞株WBF44钓取Golph2基因序列,PCR回复突变制备全长完整基因(1 206 bp),将其插入至原核表达载体pET-21、转化大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE鉴定.将纯化蛋白质免疫家兔,制备多克隆抗血清.建立Western blot 鉴定重组蛋白和抗血清特异性,测定临床血清标本中Golph2蛋白水平.结果:从肝癌细胞中钓取的基因,出现2个碱基置换突变和1个碱基缺失突变,经回复突变,获得与NM 177937完全一致序列.SDS-PAGE和Western blot证实,重组Golph2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白质和73 kD血清蛋白质.结论:Golph2蛋白质表达和抗血清制备完全成功,可以用于后续研究
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Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用
目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究.方法:PCR扩增Orai2 CDS编码序列,亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核表达载体上,将编码Orai2的pGEX-6p-1-Orai2重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Orai2融合蛋白表达,经固化的谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩,获得用于免疫的高纯度GST-Orai2融合蛋白.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,按常规方法免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体.Western blot检测抗体效价和特异性,并进行Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织鉴定.结果:经亲和纯化后的GST-Orai2融合蛋白纯度较高,BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度约0.35 mg/ml.抗Orai2多抗抗体效价达1:10 000.能特异性识别转染真核细胞获得的过表达Orai2,以及小鼠脑组织内源性的Orai2蛋白,而不与Orai1发生交叉反应.同时,用自制的Orai2多克隆抗体检测发现,与同窝野生型小鼠相比,Orai2条件性基因敲除小鼠脑组织中Orai2蛋白表达明显降低.结论:成功表达并纯化了GST-Orai2融合蛋白,获得了高敏感度、特异性的抗Orai2蛋白的多克隆抗体,该抗Orai2多抗能特异性识别过表达的和小鼠脑组织内源性Orai2蛋白,能对Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织进行鉴定,且与Orai1没有交叉反应,为进一步研究Orai2功能奠定了基础.
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志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的表达、纯化及多克隆抗体制备
目的:克隆编码志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的基因phoN2并实现表达,纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠抗Apyrase的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行评价.方法:通过PCR扩增的志贺菌5a M90T中的基因phoN2克隆至表达载体pET24a中,将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达并纯化Apyrase-HIS融合蛋白.以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多抗.Western blot、ELISA、免疫荧光鉴定获得的抗血清.结果:成功构建了原核表达载体pET24 a-Apyrase,经诱导表达出相对分子量为28 kD的融合蛋白,用纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备的多克隆抗体,通过Western blot、ELISA、免疫荧光法证明多克隆抗体制备成功.结论:成功制备了志贺菌福氏5a特异性的鼠多克隆抗体,为进一步研究Apyrase蛋白在志贺菌福氏5a M90T中的表达、定位及志贺菌福氏5a M90T的快速检测奠定了基础.
关键词： 志贺菌福氏5a M90T apyrase 多克隆抗体 -
人Fcα/μR和Poly Immunoglobulin Receptor多克隆抗体的制备及鉴定
目的:制备抗人Fcα/μR和Poly Immunoglobulin Receptor(pIgR)的多克隆抗体.方法:在Escherchia coli中分别表达人Fcα/μR的ECl2和pIgR的DI结构域,均以包含体形式存在.从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体的特异性,抗原柱吸收交叉和纯化多抗.结果:抗体滴度分别是1:6 4000和1:25 6000,经Western blot检测特异性良好,抗人Fcα/μR和pIgR的多抗相互没有交叉.结论:在E.coli中成功表达了人Fcα/μR的EC12结构域和pIgR的DI结构域,并制备了无交叉的多克隆抗体,为进一步研究其功能和相互关系奠定基础.
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中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体糖基结合域的原核表达与多克隆抗体的制备
目的:构建中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1和H2亚基糖基识别域(CRD)的原核表达质粒,体外表达纯化后制备多克隆抗体.方法:RT-PCR扩增出中国旱獭肝组织中ASGPR CRDH1和CRDH2 cDNA,将其克隆至原核表达载体pRSET-B中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内诱导表达.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性.结果:成功构建了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域原核表达质粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2,目的蛋白可以高效表达,用其免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体.结论:首次成功表达了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域多肽,且纯度高,免疫原性强,用其免疫小鼠获得的多克隆抗体特异性好、效价高,为在HBV感染模型-中国旱獭体内进行肝脏疾病的靶向治疗奠定了实验基础.
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兔抗人细胞色素P450 1A2多克隆抗体的制备及鉴定
目的:制备兔抗人细胞色素P450 1A2(CYP1A2)抗体及其特性鉴定.方法:利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列,合成CYP1A2多肽,与载体蛋白钥孔戚血蓝素(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,免疫日本大耳白兔制备抗CYP1A2抗体.辛酸-硫酸铵法纯化抗体,间接ELISA法测定抗体的效价及相对亲和力常数,Western blot鉴定其特异性,免疫组化进行定位.结果:获得针对小分子CYP1 A2的抗体.该抗体效价为1∶16 000;相对亲和力常数在105～106/M,具有实用价值;可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应;可识别正常人肝脏组织CYP1A2;Western blot的结果显示,该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为58 000.结论:合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体.制备的兔抗CYP1A2合成肽抗体可应用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组化实验.
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FILIP-1 L 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
目的：表达、纯化GST-FILIP-1L融合蛋白，制备FILIP-1L多克隆抗体。方法：pGEX-4T3-FILIP-1L重组质粒转化E． coliBL21大肠杆菌，IPTG诱导GST-FILIP-1L融合蛋白表达，Glutathion Sepharse 4B纯化GST-FILIP-1L融合蛋白。将纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔，制备FILIP-1L多克隆抗体，用ELISA方法检测多克隆抗体效价，Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白、细胞转染FILIP-1L蛋白及细胞FILIP-1L蛋白的结合能力。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的FILIP-1L融合蛋白，经Glutathion Sepharse 4B纯化后免疫新西兰大耳白兔，获得了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体，亲和层析获得纯度较高的多克隆抗体，WB检测显示多克隆抗体能够与FILIP-1L蛋白、293细胞转染FILIP-1L蛋白及肝癌细胞FILIP-1L蛋白结合。结论：成功表达、纯化了GST-FILIP-1L融合蛋白，制备了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体，为研究FILIP-1L蛋白生物学功能提供了有用的实验工具。
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制备醛固酮多克隆抗体建立检测血浆醛固酮的化学发光免疫分析法
目的:制备可用于免疫分析的醛固酮(ALD)多克隆抗体,并建立基于生物素-链霉亲和素放大系统的ALD化学发光免疫分析方法,用于测定人血液中的ALD含量.方法:对ALD进行化学改造,制备醛固酮肟,再与BSA偶联制备免疫原,免疫兔,制备抗ALD多克隆抗体.以生物素-链霉亲和素放大系统采用竞争法建立ALD化学发光免疫分析方法.结果:经检测免疫的3号兔获得的抗ALD抗体灵敏度高,50％抑制率(iC50)ALD浓度是268 pg/ml.用该抗体建立的化学发光免疫分析法的检测范围为62.5 ～2 000 pg/ml,灵敏度为23.7 pg/ml,批内变异系数为6.9％ ～9.5％,批间变异系数为8.5％～12.7％,回收率范围为93.1％ ～ 104.1％,稀释实验测定值与理论值呈线性相关,相关系数为r=0.996,与放射免疫分析试剂盒的相关性方程分别为y=0.932x+4.596,相关系数r=0.948(n=95).结论:建立的检测ALD的化学发光免疫分析法符合临床应用的基本要求.
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人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备
目的:构建人脂联素球状结构域(gAd)基因的原核表达载体PET-28a(+)-gAd,诱导表达并纯化重组gAd蛋白,制备多克隆抗体.方法:以人基因组为模板,用PCR方法扩增人脂联素球状结构域(gAd)基因,构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经SDS-PAGE,免疫印迹法检测并鉴定表达产物,表达的目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.结果:原核表达载体PET-28a(+)-gAd转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得gAd重组蛋白,免疫印迹证实能与抗his标签检测抗体结合,制备的多克隆抗体经间接ELISA法测得效价为1∶32 000.免疫印迹证实,抗血清不仅能特异性地识别gAd蛋白,还能识别脂联素蛋白,而不与非特异性蛋白结合.结论:成功构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,并表达、纯化重组蛋白gAd,制备的多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步的研究奠定了基础.
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柯萨奇病毒B组5型VP1蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备
目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测.方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白.用HisTrap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别.结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90％.ELISA测得抗体的效价为1:128000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原.结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具.
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针对晚期氧化蛋白产物的抗体制备与应用
目的:制备特异性识别晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPP)的多克隆抗体,为研究AOPP的致病机理及与临床病情相关性提供有效工具.方法:用次氯酸氧化家兔血清白蛋白以获得AOPP-RSA,以此为免疫原免疫家兔,亲和层析纯化免疫血清,ELISA鉴定多克隆抗体的效价及特异性,Western blot检测慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者血浆中AOPP,免疫组织化学方法检测肾组织中AOPP分布与定位.结果:获得效价达10-6的抗AOPP免疫血清,纯化抗体可特异地与不同种属来源的氧化修饰白蛋白结合,而与正常白蛋白及糖基化蛋白终产物无交叉反应.该抗体可识别人血浆中的AOPP,可特异地与大鼠CKD模型及各种炎症性CKD患者肾组织成份反应.结论:成功制备了可与不同种属AOPP结合的特异性多克隆抗体,并首次用于检测存在于CKD患者血浆、肾组织及模型动物肾组织中的AOPP,为深入研究AOPP的病理作用及其在组织定位提供了有效工具.
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米诺地尔多克隆抗体的制备及其酶联免疫检测方法的建立
目的:在人工合成米诺地尔抗原基础上,制备其多克隆抗体并建立相应酶联免疫检测方法. 方法:采用戊二醛法合成米诺地尔人工抗原,并通过紫外扫描进行鉴定. 用免疫原( Minoxidil-BSA)免疫BALB/c雌性小鼠,制备抗 minoxidil的多克隆抗体,并鉴定其效价. 建立检测米诺地尔的竞争ELISA法. 结果:紫外扫描结果表明米诺地尔成功地偶联到载体蛋白上. 免疫制备得到的多克隆抗体,其效价为1:12 800. 其酶联免疫检测曲线方程y=-0.0 823 x+0.938 ( R2=0.9811 ) , minoxidil质量浓度与吸光度在0.001~10 μg/ml范围内呈良好的线性关系. 结论:本研究成功制备米诺地尔人工抗原及其多克隆抗体并建立了酶联免疫检测方法,为米诺地尔免疫检测方法的实际应用奠定了基础.
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G蛋白偶联受体56胞外端融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备
目的:制备G蛋白偶联受体56(G protien-coupled recepter 56,GPR56)的高效抗体,为其功能及分子机制的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测工具.方法:以肝癌细胞株MHCC-97H的cDNA为模板,利用PCR技术扩增GPR56 N端序列(661～1 073 bp),并构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N.阳性克隆经酶切、测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达.表达产物经Western blot初步鉴定后,用GST磁珠分离纯化,纯化后蛋白与免疫佐剂混合直接免疫家兔制备抗血清.阳性血清用 ELISA、Western blot、免疫组织化学等技术对细胞或组织中的GPR56进行鉴定和分析.结果:成功构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N,GPR56N与GST的融合蛋白(GST-GPR56)在原核系统中进行了高效的可溶性表达,制备的兔抗人GPR56抗体经Western blot和免疫组织化学分析结果表明,该抗体可同时对人源性和鼠源性的GPR56进行特异性检测.结论:成功对GPR56蛋白N端序列进行了原核表达和纯化,制备的抗GPR56多克隆抗体具有较高的特异性,为GPR56功能及分子机制的深入研究奠定了坚实的基础.
