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血液存放条件对载脂蛋白A1、B测定的影响
目前,国内多采用多克隆抗体免疫法测定载脂蛋白A1(ApoAl)、载脂蛋白B(ApoB),本文观察了血清存放温度、时间对ApoAl、ApoB测定的影响,报告如下.
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HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备
目的原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体.方法利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp(384～661aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford 法检测纯化蛋白的纯度＞90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA 法检测抗体效价,Western Blot法检测抗体特异性.结果用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶ 1 280以上,能特异性识别E2蛋白.结论成功构建HCV E2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白.为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.
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抗人有机阴离子转运蛋白4多克隆抗体的制备及其在肾脏的定位研究
目的:拟采用一套新的基因免疫系统制备高特异性和高效价的小鼠抗有机阴离子转运蛋白4(hOAT4)多克隆抗体,并用该抗体对hOAT4在人肾小管上皮细胞的表达进行定位研究.方法:应用Accelrys软件分析hOAT4抗原表位,选择其中免疫源性较强的细胞内表位(E278～R345),从人肾组织总RNA中用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增其204 bp的cDNA序列,克隆到pBQAP-OVA构建基因免疫载体,鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-FlT3L同时免疫小鼠,5周后取血清抗体,ELISA方法测定抗体滴度,人肾组织Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性和定位表达.结果:成功构建基因免疫载体pBQAP-OVA-hOAT4,经酶切及序列分析鉴定完全正确.ELISA方法测得抗体滴度高达1∶3 000,该抗体识别人肾皮质膜蛋白和肾小管刷状缘蛋白65 kD糖基化的hOAT4.人肾组织免疫组化结果提示该抗体识别定位在近段肾小管上皮细胞刷状缘的hOAT4.结论:用基因免疫方法可以成功制备高效价和高特异性抗hOAT4多克隆抗体.
关键词： 肾脏 有机阴离子转运蛋白4 基因免疫 多克隆抗体 -
结核病变组织中卡介苗多克隆抗体的表达及意义
结核分支杆菌(MTB)感染所引起的结核病是威胁人类健康的重要传染病之一.在日常病理工作中,有些结核性病变在病变早期由于病变时间长、继发感染等原因使结核性病变在形态学上未形成典型的结核病变,此时单靠苏木素-伊红(HE)染色难以作出准确的诊断.且有些非结核性肉芽肿病变也容易误诊为结核;用传统的细菌学抗酸染色对结核杆菌的检出率极低.为此本研究应用免疫组织化学染色技术探讨卡介苗(BCG)多克隆抗体在结核性病变组织中的表达及意义.
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抗P37多克隆抗体的制备纯化与鉴定
目的:用P37融合蛋白免疫动物制备抗血清,为猪鼻支原体感染作用的分子机制提供依据.方法:诱导表达GST-P37蛋白并以其免疫兔制备免疫血清,ELISA法检测抗血清的效价;Western blotting检测抗血清特异性.结果:免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗P37抗体,该抗体能检测到P37蛋白的表达.结论:成功制备了抗P37的多克隆抗体,对进一步研究P37的功能提供了一个有用的工具.
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钝顶螺旋藻异藻蓝蛋白多克隆抗体的制备
异藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）是螺旋藻细胞中的主要蛋白成分之一，具有多种生理功能和广阔应用前景。本研究采用纯化的钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）APC为抗原，免疫新西兰兔，制备APC的多克隆抗体。 ELISA法提示制备的抗体效价高达1∶32000， western blot印迹法确定获得的抗体能与APC产生特异性免疫反应。这为今后进一步开展螺旋藻APC的相关研究提供了有力的工具。
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兔抗Cap43多克隆抗体制备和初步纯化
目的 制备兔抗Cap43多克隆抗体.方法 以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白(mcKLH)通过碳化二亚胺(EDC)法化学偶联成完全抗原(多肽-mcKLH)免疫家兔;制备兔抗Cap4443多克隆抗体;斑点ELISA法检测抗体效价,经辛酸-硫酸铵法初步纯化抗体后,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度.结果 经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体,抗体效价为1:500.结论 采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH,使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原,用其免疫家兔获得多克隆抗体.
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内毒素多克隆抗体制备及其在ELISA中应用
目的 制备抗大肠杆菌精制内毒素的兔多克隆抗体并建立检测内毒素的间接竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.方法 大肠杆菌精制内毒素作为免疫原,采用逐渐加强免疫剂量的方法免疫家兔,制备抗体,将抗体用于ELISA检测精制内毒素;并与复合型内毒素进行反应.结果 随着免疫次数增加,抗血清效价逐渐提高,后一次免疫后血清效价达到1∶6 400;在包被抗原浓度100 μg/mL和兔多抗稀释比1∶500佳使用条件下建立间接竞争性ELISA,内毒素浓度与吸光度(A)值成反比例关系,线性回归方程为:y=-0.1 ln(x)+0.765,检测低内毒素浓度为50ng/mL;兔血清与复合型内毒素反应效价为1∶16000.结论 成功制备出抗精制内毒素兔多克隆抗体,且能与复合型内毒素反应.
关键词： 内毒素 多克隆抗体 酶联免疫吸附试验(ELISA) -
Sao蛋白多克隆抗体制备鉴定及促全血杀菌作用
目的 制备2型猪链球菌(S.suis2)表面抗原一(Sao)重组蛋白的多克隆抗体,鉴定其免疫学特性.方法 通过PCR从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中扩增基因Sao,构建重组表达质粒pET28a-Sao,转化E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷诱导表达目的蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物,His亲和层析柱纯化重组蛋白,利用纯化后Sao蛋白制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,评价Sao多克隆抗体的促全血杀菌作用.结果 构建的重组质粒可以在宿主菌中高效表达,纯化后获得的重组蛋白纯度可达90％;间接酶联免疫吸附试验测定Sao多克隆抗体效价为1∶102400; Western blot结果显示,Sao多克隆抗体有较好的特异性;全血杀菌实验显示,05ZYH33在含有Sao多抗血清的全血中相对存活率下降85％.结论 本研究制备的2型猪链球菌重组Sao蛋白多克隆抗体效价高,特异性好,可明显增强全血对细菌的杀伤作用.
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兔抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定
背景:凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白,它不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用.目的:制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2008-08在新乡医学院免疫学研究中心完成.材料:新两兰大白兔雌性2只.体质量1.9～2.1 kg;JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司.食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者.抗原肽-KLH由上海华大天源生物科技公司合成.CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司.方法:利用美国过敏和感染疾病研究所(NIAID)主办的抗原表位分析网站(http://beta.immuneepitope.org/home.php)的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽,制备多克隆抗体并纯化.主要观察指标:采用间接ELISA、Western blot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定.结果:间接ELISA法检测显示,血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1:128000.Western blot结果显示,存在Mr67000条带.免疫组织化学检测结果显示,在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在,说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色.结论:实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体.
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重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备
背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达.由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道.目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体.方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性.观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建.②pET28a-ALR重组体酶切鉴定.③ELISA及Western-blotting检测结果.结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3 kb和0,4 kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体.成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白.ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1:2 000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求.通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白.实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求.
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抗菌肽Cecropin A基因原核表达及表达产物的鉴定
背景:Cecropins是一种具有抗菌活性的小分子蛋白质.采用真核细胞表达或人工合成Cecropins,效率低、成本高.目的:克隆表达家蝇抗菌肽基因Cecropin A,并对其重组表达产物进行鉴定.方法:依据GenBank中家蝇Cecropin A基因序列设计特异性引物,用RT-PCR从家蝇幼虫组织中扩增Cecropin A成熟肽基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,与表达载体中的Thioredoxin基因构成融合基因,并转化E.coli BL21.经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达.采用家蝇幼虫血淋巴免疫家兔获得抗血清;Western blot和三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定诱导的重组蛋白质.结果与结论:经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导,E.coli BL21可表达Cecropin A成熟肽,兔抗家蝇幼虫血清、三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot结果证实表达产物为Cecropin A成熟肽.说明使用原核表达系统可以获得天然Cecropin A成熟肽.
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抑癌基因 P16、 Rb在甲状腺癌组织中的表达
P16(Multiple tumor suppressor I,MTS I)，是一种新发现的抑癌基因，其表达产物为周期蛋白依赖性激酶 (CDKS)的抑制因子，直接参与细胞周期的调控。 Rb(retinoblastoma susceptibility gene)是第一个被成功克隆的人的抑癌基因， Rb蛋白在细胞核内能与控制 DNA的复制和转录的蛋白结合，控制细胞的增殖和分化。 P16、 Rb基因的缺失和突变与肿瘤发生、发展有着密切的关系 [1]。本研究采用免疫组织化学方法研究 P16、 Rb蛋白在甲状腺癌组织中的表达，旨在探讨 P16、 Rb蛋白在甲腺癌发生、发展中的作用及其相互关系。 1 对象与方法 1.1 对象收集白求恩医科大学第二临床学院病理科 1985～ 1996年手术切除的甲状腺癌标本 46例，男 6例，女 40例，平均年龄 42.3岁。其中乳头状腺癌 23例，滤泡状腺癌 16例，未分化癌 7例。标本经 10％福尔马林液固定，石蜡包埋切片。实验用 P16、 Rb兔抗人多克隆抗体及 SP免疫组化试剂盒均购自北京中山生物制品公司。
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生物免疫诱导治疗对肾移植患者机体免疫状态的影响
背景：目前生物制剂参与的免疫诱导治疗逐渐成为肾移植免疫抑制治疗方案的重要组成部分，既能有效预防急性排斥反应的发生，又能避免并发症的发生。目的：探讨不同生物制剂在肾移植免疫诱导治疗中对机体免疫状态及移植肾功能状态的影响。方法：回顾分析110例肾移植受者临床资料，根据应用生物免疫诱导治疗情况分组，单克隆抗体组(n=35)肾移植受者接受巴昔利单克隆抗体治疗，多克隆抗体组(n=43)肾移植受者接受兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白治疗，对照组(n=32)肾移植受者未接受生物制剂免疫诱导治疗。对比分析3组受者在肾移植后1，4，12周的淋巴细胞绝对值、外周血CD4+T淋巴细胞亚群数量，并评价移植后12周内移植肾功能状态和感染并发症发生情况。结果与结论：单克隆抗体组、多克隆抗体组急性排斥反应发生率低于对照组(P<0.05)，多克隆抗体组感染并发症发生率高于单克隆抗体组、对照组(P<0.05)。单克隆抗体组、多克隆抗体组移植后1，4，12周淋巴细胞绝对值均低于对照组(P<0.05)。多克隆抗体组移植后1，4，12周外周血CD4+T淋巴细胞亚群数量低于单克隆抗体组、对照组(P<0.05)。表明生物制剂参与的肾移植免疫诱导治疗方案可有效抑制移植受者活化T淋巴细胞功能状态，降低移植肾早期急性排斥反应的发生，但应用兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白的感染并发症发生率较高。
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CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.
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拟态弧菌VMH蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备
目的 实现拟态弧菌热不稳定性溶血素(VMH)的原核表达,制备兔抗VMH蛋白的多克隆抗体.方法 根据GenBank上已有的拟态弧菌vmh基因序列,设计并合成引物,通过PCR方法扩增vmh基因.PCR纯化产物酶切后,定向插入到PET-32a表达载体构建重组表达质粒PET-32a-vmh.重组表达质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞,在IPTG诱导下进行VMH蛋白表达.SDS-PAGE分析重组VMH蛋白(rVMH)的表达形式,并分别采用兔血平板扩散法和Western blot检测其溶血活性和免疫反应性.用纯化的rVMH蛋白免疫新西兰大白兔,3次免疫后采集免疫血清,采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法纯化多克隆抗体,并检测其纯度与效价.结果 重组表达质粒PET-32a-vmh诱导表达后,经SDS-PAGE分析发现分子量约为77.8 kDa的rVMH蛋白主要以包涵体形式表达,该蛋白经变性复性后具有溶血活性和免疫反应性.兔抗rVMH蛋白的多克隆抗体经纯化后,其纯度达95％,ELISA效价为1∶26843545600,琼扩效价为1∶32.结论 成功制备了rVMH蛋白及其多克隆抗体,为进一步采用噬菌体肽库筛选技术鉴定VMH蛋白表位提供了物质基础.
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植物乳酸杆菌CGMCC NO.1258表层黏附蛋白同致病性大肠埃希菌竞争黏附肠上皮细胞的研究
目的 了解植物乳酸杆菌CGMCC NO.1258表层黏附蛋白(IMP2)在同肠上皮细胞(Caco-2)黏附作用中的机制.方法 在制备和鉴定IMP2的多克隆抗体的基础上,同EPEC进行竞争黏附肠上皮细胞中,采用体外抗体阻断的方法检测IMP2对植物乳酸菌CGMCC NO.1258黏附作用的影响.结果 多克隆抗体能够有效抑制植物乳酸菌CGMCC NO.1258对肠上皮细胞的黏附,并且导致EPEC对Caco-2细胞黏附的增加.结论 IMP2在植物乳酸杆菌CGMCC NO.1258同肠上皮细胞黏附中发挥着重要的作用.
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鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV) AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白.方法 重组表达质粒转化感受态细胞BL21 (DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54 kDa.表达的蛋白以包涵体形式存在.对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清.结果 SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性.间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应.结论 本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础.
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羊口疮024基因的表达、多抗制备及亚细胞定位
目的 克隆表达羊口疮病毒(Orf virus,()RFV) 024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析.方法 根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增.将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024.将原核重组质粒转化Rosetta (DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况.纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析.将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24 h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位.结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta (DE3)细胞中正确表达,大小为59 kDa.Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性.荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达.结论 本实验为后续深入研究()RFV 024基因功能和致病机制奠定了基础.
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人载脂蛋白A5多克隆抗体的制备和组织分布
目的 制备人载脂蛋白A5(ApoA5)重组蛋白及其多克隆抗体,利用该抗体检测ApoA5在体内的组织分布情况,为进一步研究该分子的功能和血清水平等提供条件.方法 2004年3月至6月,中南大学湘雅二医院心内科通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,构建了含ApoA5编码基因的表达载体,表达了His-ApoA5融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备了抗ApoA5多抗;经酶联免疫吸附分析技术(ELISA)、Western-blot等方法进行鉴定,并初步用于临床组织标本的检测,观察ApoA5在体内的表达.结果 所表达的His-ApoA5融合蛋白相对分子质量约为40 ku),以其为抗原制备的ApoA5特异性抗血清具有良好的免疫反应性、较高的效价和特异性.Western印迹表明,ApoA5存在于人血清和肝组织中(无论正常血脂和高血脂者),其他组织中(心、血管、小肠、脾、肺)未见到阳性结果.结论 ApoA5存在人血清中,ApoA5在肝内表达对于血脂在肝内代谢可能具有重要的意义.
