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破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2的真核表达及多克隆抗体制备
目的：为了获得真核表达的重组蛋白OCILRP2-Fc和OCILRP2特异性抗体，用于OCILRP2生物学功能的进一步研究。方法：构建了融合人IgG Fc段的小鼠OCILRP2真核表达载体pIg-CD5-OCILRP2，将pIg-CD5-OCILRP2转染CHO细胞，G418筛选稳定表达细胞株；Protein A 亲和层析从 CHO 细胞培养上清中纯化重组蛋白OCILRP2-Fc 并免疫家兔制备OCILRP2多克隆抗体。 ELISA检测抗血清和多克隆抗体的效价，Western blot 验证多克隆抗体的特异性，并应用该抗体检测OCILRP2在树突状细胞（ Dendritic cells ，DC）中的表达。结果：ELISA结果表明OCILRP2-Fc稳定表达细胞株经过多次传代培养后仍然具有较高的蛋白表达水平；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化后的蛋白只有单一条带出现，且该条带可以被抗人IgG检测到；重组蛋白OCILRP2-Fc免疫家兔获得的抗血清和纯化后得到的OCILRP2多克隆抗体效价分别为1∶1280000和1∶320000，Western blot证明该抗体可以和免疫原OCILRP2-Fc及NIH/3T3细胞中表达的OCILRP2特异性结合。应用该抗体检测OCILRP2在 DC 的表达发现 OCILRP2在成熟 DC 的表达明显高于不成熟 DC。结论：获得了真核表达的重组蛋白OCILRP2-Fc和高效价的OCILRP2特异性抗体，为进一步研究OCILRP2在免疫应答中的功能奠定了基础。
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人Argonaute3蛋白:多克隆抗体制备、鉴定及组织芯片检测其在各种癌组织中的表达
目的:制备兔抗人Argonaute3(AGO3)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法:合成特异性AGO3多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备兔抗人AGO3多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和Western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO3的免疫组化研究.结果:通过构建AGO3多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人AGO3蛋白多克隆抗体,末次抗血清效价为l:20 000,经ELISA及Western blot证实兔抗人AGO3抗体可特异性识别AGO3多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在很多正常组织上皮细胞及肿瘤细胞胞浆中呈阳性染色.结论:本项研究成功制备兔抗人AGO3多克隆抗体,为进一步研究AGO3在微小RNA/RNA干扰通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具.
关键词： Argonaute3蛋白 多克隆抗体 组织芯片 -
桃拉综合征病毒VP1高变区蛋白抗体制备及初步特性分析
目的：制备高效价的桃拉综合征病毒主要结构蛋白VP1高变区蛋白抗体，分析其免疫特性，为研究免疫诊断试剂做参考。方法：将pET-VP1重组载体转化入大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下进行表达。重组VP1蛋白纯化后免疫新西兰家兔，用琼脂扩散试验及ELISA检测抗体效价，用与VP1纯化蛋白特异性结合的单克隆噬菌体做竞争抑制试验。结果：pET-VP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。抗血清经琼扩试验鉴定效价达1∶26，ELISA效价达1∶217。与VP1蛋白特异结合的单克隆噬菌体能阻断部分抗血清与VP1蛋白的结合活性，但不影响终检测阳性的判断。结论：制备的VP1高变区蛋白抗体效价高，VP1蛋白少数区域的位点变异并不影响多克隆抗体的结合活性，可用作免疫检测诊断试剂。
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黄曲霉毒素M1人工抗原的制备及鉴定
目的：合成黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）免疫抗原和检测抗原，并对其进行鉴定。方法：采用肟化法改造AFM1，并用薄层色谱法监测肟化反应进程，对肟化物鉴定。将肟化物分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上，得到免疫原AFM1-BSA和检测原AFM1-OVA，然后分别用紫外分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ SDS-PAGE）对合成抗原进行鉴定。经动物免疫试验获得鼠源多抗血清，用酶联免疫吸附法（ ELISA）对多抗血清进行检测，判断抗原是否偶联成功。结果：肟化改造后，肟化物在薄层板上的迁移距离缩短；偶联物AFM1-BSA在274 nm处出现大吸收峰，且与BSA和AFM1的紫外吸收峰都不重合；AFM1-BSA的泳动速度明显小于BSA；免疫的3只小鼠效价均在1×10-4左右，其中3号小鼠多抗血清敏感性好，半数抑制浓度IC50（50％inhibitive concentration ，IC50）为359.9 ng/ml。结论：本试验成功制备出AFM1人工抗原，并得到了敏感性好的鼠源多抗血清。
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人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用
目的:制备人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.方法:用DNAstar软件寻找抗原性高的Ago2序列区域(命名为k-Ago2),构建k-Ago2的表达质粒,转化大肠杆菌并诱导表达.融合蛋白经切胶回收纯化后免疫大白兔制备抗体.以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测Ago2在细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察Ago2的细胞定位.结果:成功构建表达质粒,继而k-Ago2得以表达与纯化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗体.ELISA检测抗体效价为1∶19 000,Western blot确定抗体具有高度特异性,并成功地用该抗体检测到Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.结论:Ago2多克隆抗体的成功制备,对RNAi机制的深入研究及其进一步的临床应用均具有重要价值.
关键词： Argonaute2蛋白 多克隆抗体 RNA干扰 RNA诱导沉默复合体 -
annexinA2基因片段的克隆、表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的:构建人源annexinA2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法:从GenBank(BC093056.1) 中获得人源annexinA2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码annexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexinA2的蛋白.表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot 鉴定.用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexinA2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度.在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexinA2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性.结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexinA2构建成功,可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexinA2蛋白.纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA 滴度达 1:640 000).CIF和 FCM 结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性.结论:构建了annexinA2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexinA2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础.
关键词： 人源annexinA2基因片段 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体 -
多巴胺能神经营养因子真核表达、纯化及多克隆抗体制备
目的：获得具有活性的脑多巴胺能神经营养因子（ CDNF ）蛋白并制备 CDNF 多克隆抗体。方法：选用VR1012作为真核表达载体，在HEK293T细胞中表达带有his标签的CDNF蛋白，镍柱亲和层析进行纯化，SDS-PAGE检测纯化情况，Western blot鉴定蛋白的正确性，MTT检测CDNF蛋白对PC12细胞的保护活性。免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。结果：构建的pVR1012-CDNF-his在HEK 293T细胞中高效分泌表达，镍柱亲和层析获得纯度90％以上的CDNF蛋白， MTT结果显示纯化获得的蛋白具有对PC12细胞的保护作用。免疫动物后，成功制备出CDNF 多克隆抗体。结论：通过HEK293 T细胞中表达-镍柱亲和层析获得具有纯度较高且具有生物活性的CDNF蛋白，并成功制备多克隆抗体以方便后续对于CDNF应用及相关机制的研究。
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特异性IFN-α2b多克隆抗体的制备及鉴定
干扰素α家族至少有15个亚型,彼此之间有78%～98%的同源性[1],尤其是IFN-α1和IFN-α2亚型之间的差异更小.以不同亚型的干扰素制备的多克隆抗体与抗原之间有很多的交叉反应.本文利用自行设计的亲和层析组合柱从复杂的多克隆抗体中除去与其他干扰素有交叉反应的抗体,得到针对IFN-α2b的特异性抗体.这种纯化IFN-α2b多克隆抗体的方法非常简便快捷.
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EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用
目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关.本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平.结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EGFL7.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质.结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.
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重组多克隆抗体——一类新的治疗制剂
抗体作为治疗制剂已有上百年历史,主要有抗血清和单克隆抗体,抗血清对多表位抗原的中和能力较强,但是,抗血清安全性低、供应量有限、批次间差异大、有效抗体成分低,而且不能进行基因改造;单抗药物的特异性强、重复性好、能够进行基因操作、安全性高,不过,在由多表位抗原或者是突变较快的病原体引起的疾病治疗中,单抗的疗效相对较差;重组多克隆抗体几乎拥有抗血清和单抗的所有优点,在多种疾病比如感染和癌症的治疗中将体现其巨大的优势和良好的临床应用前景.本文将对这一类新型抗体治疗制剂做简要综述.
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改变半抗原与载体蛋白的连接桥对提高水杨酸ELISA灵敏度的影响
目的:探讨水杨酸(SA)与载体蛋白间连接桥的改变对识别SA抗体的产生及SA ELISA灵敏度的影响.方法:将SA、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸分别用不同的方法与载体蛋白相偶联,从而在SA苯环的C4、C5两个不同位点合成了3种免疫原:SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)和SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)及4种包被物:SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA.免疫新西兰白兔制备抗体,用ELISA法检测.结果:获得针对A和C的两种多克隆抗体,后一种能专一识别游离态水杨酸,改变包被物中连接桥的结构可提高SA ELISA的检测灵敏度,故选用SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA建立了SA ELISA.结论:SA与载体蛋白间连接桥的改变对识别SA抗体的产生和SA ELISA的灵敏度有很大影响.
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双抗体夹心ELISA检测人胎儿血红蛋白体系的建立
目的 建立一种定量检测人胎儿血红蛋白(HbF)的双抗体夹心ELISA方法.方法 用抗人HbF单抗作为捕获抗体,加入待测抗原,检测抗体为兔抗人HbF多克隆抗体,后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG.结果 本检测体系灵敏度约为0.039 μg/ml,测量范围0.039-24.66 μg/ml,特异性强,重复性好,100份血标本的检测结果与高效液相色谱法结果符合率高.结论 建立了一种可用于检测人外周血HbF的双抗体夹心ELISA方法,有望为临床上诊断某些与HbF有关的疾病提供帮助.
关键词： 胎儿血红蛋白 双抗体夹心ELISA 多克隆抗体 -
一种新的肿瘤相关蛋白-OVA12和抗体制备及其初步应用
目的制备原核表达的OVA12纯化蛋白,研究正常人与肿瘤患者血清中抗OVA12抗体水平的差异.方法克隆OVA12的cDNA至pGEMT载体中,经测序确证后,将该基因插入原核表达载体pET32a(+)中,并转化至E.coli表达菌BL21(DE3)中,诱导6×His融合蛋白表达,经Ni2+亲和层析及胶回收技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物制备兔抗OVA12蛋白抗体;采用ELISA、Dot blot、Western blot法比较正常人及肿瘤患者血清中抗体水平的差异.结果获得纯化OVA12蛋白及高滴度的兔抗血清;ELISA法测定显示,正常人组OD均值为0.17±0.07,肿瘤患者组OD均值为0.32±0.15,两组之间有显著性差异(P＜0.0001),并选择其中样本经Western blot、Dot blot加以进-步证实.结论成功克隆OVA12基因,并获得纯OVA12蛋白和高滴度的兔抗血清;ELISA等方法测定肿瘤患者与正常人血清中OVA12抗体水平有明显差异,为临床检测的应用奠定基础.
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呼吸道合胞病毒多克隆抗体的制备及临床意义
目的制备呼吸道合胞病毒(RSV)多克隆抗体,为RSV的检测提供条件.方法用RSV颗粒抗原免疫新西兰家兔3只,采用细胞病变中和实验检测RSV多克隆抗体.结果细胞病变中和实验结果显示,本研究制备的RSV多克隆抗体在1:1102的稀释度能保护50%的Hela细胞免受RSV的攻击,而阴性对照血清不能保护细胞对病毒的感染.结论 RSV颗粒抗原免疫新西兰家兔可成功制备RSV多克隆抗体,1:1102稀释的血清可保护50%的细胞不产生病变.
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猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位
目的:构建猪LIF原核表达载体,表达并纯化重组猪LIF蛋白,制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位.方法:根据GenBank中猪LIF cDNA基因序列扩增出目的基因片段,将扩增的片段克隆进PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白,纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性;后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位.结果:酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20 000的位置上有明显的增强表达条带;纯化结果显示,重组蛋白在相对分子质量约20 000的位置上有一条清晰、单一的条带;通过免疫新西兰大白兔,获得了特异性较高、效价达1:10 000的多克隆抗体;应用该抗体进行的免疫定位显示,LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达.结论:重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达;得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体;LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达.
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巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2的克隆表达及其与骨质疏松症的关系
目的:探讨巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2(PTPMEG2)的克隆表达及其对骨质疏松症发展过程的调节作用.方法:分离纯化后的PTPMEG2蛋白,应用免疫学技术制备PTPMEG2的多克隆抗体.30只雌性SD大鼠随机分为模型组(n=15)和对照组(n=15),采用维甲酸灌胃给药的方法构建大鼠骨质疏松症模型,对照组大鼠采用生理盐水灌胃,检测2组大鼠血清中酸性磷酸酶(ACP)及碱性磷酸酶(ALP)的水平.Western blotting 法检测大鼠各组织中PTPMEG2的表达水平,并对比PTPMEG2在骨髓细胞(BMCs)、红细胞及骨髓基质细胞(BMSCs)中表达量的变化.结果:成功制备PTPMEG2的多克隆抗体.模型组大鼠血清中ACP和ALP表达水平均高于对照组(P＜0.01),且模型组大鼠的骨脆性明显高于对照组.模型组大鼠肾脏组织中PTPMEG2的表达水平高于对照组(P＜0.05),而其在肌肉组织中的表达水平却低于对照组(P＜0.05).与对照组比较,PTPMEG2在模型组大鼠BMCs中表达量显著增加,而在红细胞和BMSCs中其表达量无明显差异.结论:骨质疏松症大鼠BMCs中PTPMEG2表达水平增加,且多发生在骨髓内分化成熟的骨细胞中；PTPMEG2可能在骨质疏松症的发展过程中发挥重要的调节作用.
关键词： 巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2 多克隆抗体 骨质疏松症 -
单增李斯特菌多克隆抗体制备及其在乳胶凝集试验中的应用
目的:制备高效价高纯度兔抗单增李斯特菌(LM)多克隆抗体,并初步探讨其在乳胶凝集试验(LAT)中的应用.方法:复苏并扩大培养LM标准菌株,制备灭活疫苗免疫家兔,采用ELISA法测定耳缘静脉血抗体效价.4次免疫后,颈动脉采血分离血清,采用辛酸-饱和硫酸铵法粗分离,经蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行IgG纯化,采用SDS-PAGE电泳、紫外分光光度法、间接ELISA法分别测定蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价.得到的高效价提纯IgG与乳胶微球进行共价偶联,并选择偶联乳胶的IgG含量及偶联时间等条件,建立快速检测模拟样品中LM的方法.结果:制备并纯化的兔抗LM IgG蛋白浓度为23.364 g·L-1,效价为1∶12 800～1∶25 600,与霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺菌等多种菌均无交叉反应,与斯氏李斯特菌有弱交叉反应；致敏时IgG与乳胶微球偶联比率为1∶40;利用LAT方法检测246份样品,阳性检出率为87.5％,低检出抗原含量为0.039 8 g· L-1.结论:制备了高效价、高纯度的兔抗LM多克隆抗体；建立的LAT方法特异性强,敏感性较高,重复性好,便于基层推广使用,为LM的现场检测提供了一种新手段.
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抗单纯疱疹病毒多克隆抗体治疗兔单纯疱疹病毒性角膜炎
目的:观察抗单纯疱疹病毒多克隆抗体(PcAb)治疗单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)的疗效.方法:对实验性单疱病毒角膜炎采用PcAb滴眼治疗,同时用无环鸟苷及盐水对照.结果:其临床疗效与病毒分离结果提示,角膜组织的病变程度明显减轻,并可抑制病毒向周围细胞扩散和缩小病灶范围.结论:PcAb作为一种新型生物制剂,为治疗HSK开辟了一条新途径.
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人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备
目的:构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体.方法:利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段.将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白.融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体.后经Western blotting检测和斑点杂交(DIBA)进行抗体效价测定.结果:酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1:1 000的多克隆抗体.结论:人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高.
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单纯疱疹病毒胸苷激酶多克隆抗体的制备
目的:克隆单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因,并在大肠杆菌中表达,通过免疫家兔,获得HSV-TK多克隆抗体,为进一步研究HSV-TK的功能奠定基础.方法:从纯化的单纯疱疹病毒(HSV)中提取病毒基因组,用PCR特异性扩增HSV-TK全长基因,克隆人表达载体pRSET B中进行表达,以纯化的表达产物免疫家兔制备多克隆抗血清,进行Western blotting鉴定.结果:用IPTG诱导后,表达出相对分子质量(Mr)约43 000的融合蛋白,免疫家兔制备的兔血清,第2～5周每周采血1次,Western blotting检测均获得特异性蛋白带;后一次样品3个稀释度(1:1 000、1:3 000、1:5 000)的Western blotting分析仍可以检出蛋白质带.结论:成功获得了特异性强和滴度高的HSV-TK多克隆抗体.
