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GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备
目的:构建pGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体.方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性.结果:经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/hZimp10重组质粒中包含384 bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符.间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1∶100 000以上.Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性.结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体.
关键词： hZimp10 谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白 多克隆抗体 -
兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用
目的:采用已构建的pET28a-△PTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP-oc)多克隆抗体并鉴定其性能.方法:将构建的pET28a-△PTP-oc重组质粒转化至BL21 (DE3)中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达.表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体.采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性.结果:成功纯化出PTP-oc重组蛋白.间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1:32 000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性.结论:成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体.
关键词： 破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶 多克隆抗体 鉴定 破骨细胞 效价 -
犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定.方法:以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NP1蛋白.用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备NP1抗血清并用ELISA法测定抗血清效价.采用Western blotting和免疫荧光法检测NP1抗血清的特性.结果:成功构建MVC NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的NP1融合蛋白,以其免疫大白兔获得NP1多抗血清,ELISA法检测效价达到1∶400 000.Western blotting法及免疫荧光检测,所得抗血清具有较高的效价及特异性.结论:本研究利用原核表达的MVC GST-NP1融合蛋白制备的NP1抗血清效价高、特异性高,为进一步深入研究NP1在MVC感染及致病分子机制中的作用奠定了基础.
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大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价
目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用.方法:复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔.4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行IgG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定.应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记.比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果.结果:HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的佳纯化方法为35％、100％二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25 600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,佳FITC与蛋白量比值为1∶10,佳标记反应条件为20℃、2h.由佳条件制得的荧光抗体与E.coli O157∶H7反应明显,强荧光连续照射15 min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡萄球菌反应.结论:本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coli O157∶H7 FITC标记多克隆抗体,为E.coli O157∶H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤.
关键词： 大肠杆菌O157∶H7 多克隆抗体 荧光免疫 异硫氰酸荧光素 -
建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备
目的:对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs) Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体.方法:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET 30a Cystatin的E.coliBL21 (DE3)表达重组蛋白,经过Ni2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用.利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性.结果:原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度＞95％;Azocasein法检测,0.014 μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50％以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1:512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合.结论:成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清,具有高特异性和灵敏性.
关键词： 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 原核表达 多克隆抗体 -
麻风分枝杆菌热休克蛋白65的表达、纯化及其多克隆抗血清的制备
目的 原核表达、纯化麻风分枝杆菌热休克蛋白65(Heat shock protein 65,HSP65),并制备其多克隆抗血清.方法 以含hsp65基因的真核表达质粒pCMV4.65为模板,PCR扩增hsp65基因,克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET-28a-hsp65,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清,Western blot分析重组蛋白的反应原性.结果 重组表达质粒pET-28a-hsp65经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65 000,表达量约占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%,浓度约为1.0 mg/ml;制备的HSP65多克隆抗血清效价可达1:12 800;重组蛋白具有良好的反应原性.结论 已成功表达、纯化了麻风分枝杆菌重组HSP65蛋白,并制备了HSP65多克隆抗体,为进一步研究以HSP65为基础的亚单位疫苗和核酸疫苗奠定了基础.
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曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 原核表达曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子(IL-4-inducing principle of schistosoma eggs,IPSE),并制备小鼠多克隆抗体.方法 人工合成IPSE基因,采用PCR技术克隆其成熟体开放阅读框,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-IPSE.转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后,应用组氨酸标签蛋白纯化柱纯化包涵体蛋白,免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体.结果 克隆的IPSE基因与GenBank中登录的基因序列同源性为100％;重组表达质粒pET-28a-IPSE经PCR及双酶切鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为16 000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30％,可与鼠抗His单抗特异性结合；用纯化的包涵体蛋白免疫BALB/c小鼠后,获得的特异性抗血清效价为2× 10-4,该血清可与IPSE蛋白发生特异性反应.结论 已原核表达、纯化了曼氏血吸虫IPSE蛋白,并制备了高滴度的特异鼠抗血清,为进一步从日本血吸虫中筛选相似蛋白及研究其功能奠定了基础.
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小鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱα融合基因的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 原核表达LHRH-TAT-DNaseⅡα融合基因(LTD),并制备多克隆抗体.方法 采用PCR法克隆LTD基因片段,插入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-LTD,转化大肠埃希菌BL21 (Rossetta),经IPTG诱导表达.融合蛋白经电洗脱分离纯化后,免疫獭兔,制备LTD蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗血清效价.结果 构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;纯化得到的融合蛋白相对分子质量为39 270,浓度为0.5 mg/ml,可被兔抗LTD抗体识别.血清抗体效价可达1∶6 400.结论 成功原核表达了DNaseⅡ融合蛋白LTD,并制备了多克隆抗体,为进一步研究DNaseⅡ蛋白体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础.
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莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT70的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达及纯化莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT70,并制备其多克隆抗体.方法 以质粒pGAD-ift70(含莱茵衣藻 ift70基因N-末端编码380个氨基酸的核酸序列)为模板,分别构建带有6×His和MBP标签的原核表达质粒pET-28A-ift70和pMAL-C2X-ift70,转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达6×His-IFT70和MBP-IFT70融合蛋白,并进行亲和层析.将纯化的MBP-IFT70融合蛋白免疫2只新西兰大白兔,经耳动脉采血,分离血清,ELISA法测定抗体效价,经两步亲和纯化后进行Western blot及免疫荧光法分析.结果 经双酶切及测序鉴定证明原核表达质粒pET-28A-ift70和pMAL-C2X-ift70构建正确.6×His-IFT70和MBP-IFT70融合蛋白的相对分子质量分别为40 000和80 000,纯化后纯度可达90％.家兔1及家兔2抗血清的效价分别为＞128 000及＞256 000,纯化的抗血清可与莱茵衣藻IFT70蛋白发生特异性结合,于相对分子质量约70 000处可见特异性结合条带,可与野生型莱茵衣藻CC-125纤毛上的IFT70蛋白发生特异反应,荧光显微镜下可见红色荧光.结论 成功制备了抗莱茵衣藻IFT70的多克隆抗体,为IFT70在IFT和纤毛组装中作用的深入研究奠定了基础.
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14-3-3 zeta蛋白C-端多肽抗体的制备与鉴定
目的 制备14-3-3 zeta蛋白C-端多肽多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法 用生物信息学分析14-3-3 zeta蛋白的同源性、亲水性和抗原性,设计并合成zeta蛋白C-端特异性的氨基酸序列,将其与牛血清白蛋白铰链;分别转化14-3-3的7个亚型质粒于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并分离纯化His-zeta融合蛋白;分别以zeta C-端多肽及zeta融合蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体;用Western blot分析zeta蛋白C-端多肽抗体亚型特异性,并用该特异性抗体检测zeta蛋白在COS-7细胞中的分布规律.结果 在14-3-3的7个亚型蛋白存在的条件下,zeta蛋白C-端多肽抗体仅识别zeta亚型蛋白,而zeta融合蛋白抗体可以识别gamma、zeta、tau 3种亚型;14-3-3 zeta蛋白主要分布在COS-7细胞质一侧.结论 已获得了亚型特异性的14-3-3 zeta多克隆抗体,该抗体可用于14-3-3 zeta免疫细胞化学等分析.
关键词： 14-3-3 zeta蛋白 C-端多肽 多克隆抗体 生物信息学 特异性 -
重组SARS病毒N蛋白的制备及其初步应用
目的 在大肠杆菌中表达重组SARS-CoV N蛋白,并进行纯化,为进一步研制SARS早期诊断试剂奠定基础.方法 通过RT-PCR获得SARS-CoV N蛋白基因片段,并克隆至大肠杆菌表达载体pQE30中,构建重组质粒.转化E.coli M15,IPIG诱导表达.经SDS-PAGE和Western blot鉴定,采用Chelating-Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,并免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平.结果 所构建的重组表达载体pQE30-N经诱导可表达重组SARS病毒N蛋白.该蛋白纯化后,纯度可达90%左右.Western blot检测表明,重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者恢复期血清呈现特异的免疫反应.免疫BALB/c小鼠可获得高效价抗血清.结论 重组SARS-CoV N蛋白具有良好的抗原性,可用于SARS-CoV感染的早期诊断.
关键词： 严重急性呼吸综合征冠状病毒 N蛋白 诊断试剂 多克隆抗体 -
金黄色葡萄球菌表面蛋白的表达及其多克隆抗体的制备
目的 在原核细胞中表达金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(fibronectin-binding protein A,FnBPA),制备其多克隆抗体.方法 筛选FnBPA抗原表位富集区,优化基因序列,分别克隆至质粒pGEX4T-2和pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pGEX4T-2-fnbpa和pET-28a-fnbpa,分别转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,分别用High Affinity GST-NTA resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化.以纯化后的FnBPA-His融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,以FnBPA-GST融合蛋白为检测抗原,采用间接ELISA法检测血清效价,Western blot法检测特异性.结果 经双酶切及测序鉴定,证明质粒pGEX4T-2-fnbpa和pET-28a-fnbpa构建正确;在相对分子质量约42 000和19 000处,分别可见FnBPA-GST和FnBPA-His融合蛋白的表达,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,均以可溶性形式表达,纯度均在90％以上;免疫新西兰大白兔后获得高效价的特异性兔抗血清.结论 2种标签的融合蛋白均具有较好的免疫原性和抗原性,所制备的多克隆抗体具有较好的特异性,为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础.
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小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)弱毒疫苗株血凝素蛋白(H)主要抗原表位区进行克隆及原核表达,并制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体.方法 根据GenBank中登录的PPRV弱毒疫苗株H基因序列设计引物,RT-PCR扩增其主要抗原表位区域(去掉信号肽及跨膜区);将扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)后,转化E.coli Transetta(DE3),经IPTG 37℃诱导表达目的蛋白;表达的目的蛋白经带His标签的镍离子蛋白纯化柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定;将纯化的H蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫昆明鼠,3次免疫2周后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光试验进行鉴定.结果 质粒pET-30a(+)-H经双酶切鉴定证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约60 000,能同时被抗His标签抗体和PPRV阳性绵羊血清识别,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的48％,纯度可达90％以上;制备的多克隆抗体能够识别PPRV全病毒抗原以及杆状病毒表达的重组PPRV H蛋白.结论 成功构建了质粒pET-30a(+)-H,并表达了PPRV H蛋白,制备的鼠源多克隆抗体为建立针对PPRV H蛋白的ELISA抗体检测方法及研制新型亚单位疫苗奠定了基础.
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牛轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体.方法 根据GenBank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-Bo-RV-VP6,转染至E coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Westernblot分析.将重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫豚鼠,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周,经心脏采血,分离血清,制备VP6多克隆抗体,Western blot法检测其与牛RV的反应原性.结果 经双酶切和测序鉴定,重组表达质粒pET-28a-Bo-RV-VP6构建正确.重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物分别为43 000、34 000、27 000和15 000 4种不同相对分子质量的重组蛋白,纯化后纯度可达95％以上,可与牛RV阳性血清发生特异性反应.制备的VP6蛋白多克隆抗体效价＞1∶7 000,且可识别RV天然VP6蛋白.结论 原核表达了牛RV VP6蛋白,并制备了抗VP6多克隆抗体,为后续RV疫苗效力评价及RV侵入机理等方面的研究奠定了基础.
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狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白密码子优化、原核表达及多克隆抗体的制备
目的 对狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白(matrix protein,MP)密码子进行优化,原核表达重组蛋白,并制备多克隆抗体.方法 通过GenBank查找狂犬病病毒CTN-1株M蛋白编码序列并体外合成,将目的 序列插入原核表达载体pET-28b,构建重组质粒pET-28b-M,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达M蛋白,经亲和层析和复性后,免疫豚鼠制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA检测多抗的免疫反应性以及效价.结果 成功构建了pET-28b-M重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,经亲和层析及透析获得纯化的重组M蛋白,制备的多克隆抗体可与M蛋白发生特异性结合,效价达1∶21 870.结论 成功优化表达了狂犬病病毒CTN-1株M蛋白,制备了高效价的多克隆抗体,为后续M蛋白生物学分析以及新型狂犬病疫苗的研究奠定了基础.
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牛源大肠杆菌F41菌毛蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备
目的 原核表达及纯化牛源产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC )F41菌毛蛋白,并制备F41菌毛蛋白的多克隆抗体.方法 以ETEC基因组为模板,采用PCR法扩增F41菌毛基因,克隆入表达载体pQE-30,转化大肠杆菌XLl-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析,表达产物经切胶纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot分析F41菌毛蛋白与多抗的反应原性.结果 重组表达质粒pQE-30-F41经双酶切及测序证实构建正确；F41菌毛重组蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为32 000;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35％,纯化的重组蛋白纯度可达92％；制备的抗血清效价达1:2.56×106以上,Western blot结果表明F41菌毛蛋白与制备的多抗具有良好的反应原性.结论 已成功原核表达并纯化了F41菌毛重组蛋白,且制备了高效价的多克隆抗体,为单克隆抗体制备及其免疫检测方法的建立奠定了基础.
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人星状病毒非结构蛋白nsP1a/3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达、纯化人星状病毒(human astrovirus,HAstV)非结构蛋白nsP1a/3,并制备多克隆抗体.方法 酶切质粒nsP1a/3-pCDNA3.1,获得nsP1a/3基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒nsP1a/3-pET-28a,转化大肠埃希菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,并优化表达条件.表达的重组蛋白经Ni2+亲和层析纯化后,经腹腔免疫SD大鼠,共4次,后1次免疫7d后,经心脏采血,分离血清,ELISA法检测多抗效价,Western blot鉴定多抗的特异性.结果 重组表达质粒nsP1a/3-pET-28a经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为22 500,以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度为86.6％,浓度为1.26 mg/ml;制备的多克隆抗体效价较高,可达1:30 000,且特异性较好.结论 成功地原核表达、纯化了HAstV非结构蛋白nsP1a/3,并制备了特异性良好的鼠多克隆抗体,为进一步研究nsP1a/3蛋白在病毒侵染靶细胞时的作用机制奠定了基础.
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人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备
目的 克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体.方法 应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达.表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化.纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Western blot检测其特异性.结果 测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致.该基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白.重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%.每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438 mg.Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白.ELISA法测得抗体效价为1∶ 12 800,Western blot证实其具有较好的特异性.结论 已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体.
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基于免疫磁珠快速富集分离土壤中炭疽芽孢方法的建立
目的 建立基于免疫磁珠快速富集分离土壤中炭疽芽孢的方法.方法 将炭疽芽孢杆菌疫苗株培养形成芽孢,灭活后免疫家兔,获得多克隆抗体,与磁珠偶联制备免疫磁珠,并检测其在纯炭疽芽孢稀释液中对炭疽芽孢富集分离的敏感性.通过对模拟土壤样品中炭疽芽孢抽提效果的比较,选择优的芽孢抽提液及抽提条件.采用多重PCR法评价免疫磁珠对土壤中的炭疽芽孢在PLET平板培养基上富集分离的效果.结果 10 mg磁珠经活化后与500 μL抗体偶联效果佳,制备的免疫磁珠在纯炭疽芽孢稀释液中,富集分离的敏感性可达19 cfu/mL.以0.5％Triton X-100蔗糖PBS溶液作为芽孢抽提液,经1 000×g离心5 min后芽孢提取率高.在模拟土壤样品中,检测敏感性可达100 cfu/g土壤,PLET平板培养基检测的阳性率达30％.结论 本研究建立的免疫磁珠法简单实用,适用于土壤等各种类型环境样品中炭疽芽孢的检测.
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犬粪便中细粒棘球绦虫抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用
目的 建立简便、特异的检测犬粪便中细粒棘球绦虫抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用.方法 以细粒棘球绦虫EdiagA864蛋白为抗原,免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体;利用HRP标记兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体,通过溶解、超声方法处理犬粪便样品;以抗细粒棘球绦虫单克隆抗体2D12作为捕获抗体,HRP标记的兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体为检测抗体,通过棋盘法确定抗体佳包被浓度、佳封闭剂、待检粪样佳稀释比例及酶标抗体佳浓度.应用建立的双抗体夹心ELISA法对来自长春地区的64份犬粪便样品及来自新疆的8份犬粪便阳性样品进行检测.结果 兔抗EdiagA864多克隆抗体的效价为105.建立的双抗体夹心ELISA法的佳检测条件为:抗体包被浓度为1∶50,封闭剂为1％ BSA,粪液稀释度为1∶5,酶标二抗稀释度为1:800.建立的双抗体夹心ELISA法与犬贾第虫和犬蛔虫阳性样品均无交叉反应;检测不同稀释度的粪便液,当稀释至1∶20时,P/N仍大于2;检测6份阳性样品与4份阴性样品的批间和批内变异系数均小于8.用建立的方法检测8份阳性样品的结果均为阳性,64份待检样品的结果均为阴性.结论 建立的双抗夹心ELISA方法特异性较强,敏感性较高,重复性较好,为细粒棘球绦虫流行病学调查及诊断提供了一种更简便、快速、特异的免疫学检测方法.
关键词： 细粒棘球绦虫 双抗体夹心ELISA EdiagA864 多克隆抗体
