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3株登革病毒1型广东分离株NS 1基因序列测定
登革热(Dengue fever,DF)是一种急性虫媒传染病,严重者表现为严重的登革出血热或登革休克综合征,后者死亡率可达5%.广东省自1978年以来,先后有10多次登革热暴发流行.
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吐鲁番地区乡村小学生感染蓝氏贾第鞭毛虫基因型的研究
目的 了解吐鲁番地区乡村小学生感染蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)的基因型及亚型,探索不同地域贾第虫分离虫株基因之间的蓝氏贾第鞭毛虫的相互关系.方法 对感染贾第鞭毛虫的小学生粪便内的蓝氏贾第鞭毛虫的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,简称为tin/tpi)基因进行基因检测和基因序列分析.结果 19个分离虫株为集聚体A型,11个分离虫株为集聚体B型.结论 人群感染蓝氏贾第鞭毛虫分离虫株种之间的进化关系不受不同地理区域分布的影响,而虫株亚种之间可能受不同地理区域分布的影响有差别.
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16S rRNA基因序列分析在临床微生物学中的应用
20世纪70年代前,生物类群的区分主要是根据形态和结构、生理和生化特征、行为习性表现以及少量的化石资料来进行的.这种通过表型特征鉴定的方法对细菌之间的亲缘性判断有时不够准确.随着分子生物学的发展,人们开始利用生物大分子特别是蛋白质和核酸的结构特征,作为判断生物进化关系的主要特征.其中Woese等[1]通过寡核苷酸编目的方法,在20世纪70年代逐渐发展出1种新的鉴定细菌的标准,即通过比较1段稳定的遗传编码--16S rRNA基因序列来分析和鉴定细菌的种系发生关系,判断其亲缘性,对细菌进行分类.
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一例Wolfram综合征患者的临床及家系WFS1基因分析
Wolfram综合征(OMIM 222300)又称为DIDMOAD(diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy, deafness)综合征,是一种常染色体隐性遗传性、神经退行性疾病,由Wolfram在1938年首先报道[1]。1998年确定其致病基因为 WFS1,定位于4p16.1,WFS1基因主要表达于胰岛β细胞和神经元上,编码890个氨基酸组成的跨膜蛋白Wolframin[2]。其可抑制内质网应激,若基因突变,功能障碍,可致内质网应激,细胞凋亡,导致血糖高,听力下降,视力下降,尿频等表现。本例患者通过临床症状及WFS1基因序列分析,确诊为Wolfram综合征,并发现了一个未报道过的突变。
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中国幽门螺杆菌vacA基因的等位变异
目的明确中国幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)全长vacA基因的等位变异及其与西方主要菌株基因序列的差异。方法从5例胃病患者胃黏膜活检组织中分离培养22个单个Hp克隆，以Western blot确定vacA表型特点，以体外细胞毒性试验确定其活性。然后选择5株有代表性的克隆进行基因组DNA抽提、PCR扩增及vacA基因全序列测定、分析。结果 5株中4株vacA表达阳性。只有1株(5060d)可在体外诱导HeLa细胞产生显著空泡变性。5株vacA基因有相同的信号序列(sla)及相似的编码相对分子质量为37×103和跨膜输出段(outermembrane exporter，OME)的基因序列。4株vacA基因的中间区(编码相对分子质量为58×103蛋白)表现为m2型等位基因，1株为m1型。同型中国Hp vacA基因相似率为97．6％～99．2％，高于西方同型相似率(92．1％)。结论中国人Hp vacA基因与西方菌株相比存在显著的等位变异，形成相对独立的一个亚簇。m2型菌株比m1型菌株常见。细胞毒活性与vacA基因中间区类型有关，而与信号序列无关。
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HPV16病毒中国山西襄垣流行株基因HPV16Z的序列分析
目的:分析中国山西襄垣地区人乳头瘤病毒16型HPV16Z基因的结构特点.方法:对HPV16Z进行双向测序,并将其基因全序列与德国标准株进行对比分析.结果:DNA序列分析表明,HPV16Z与已发表的德国标准株基因长度相等,其中LCR和L1、E6部位的核酸片段存在变异.LCR的变异部位分别位于7431～7432 nt、7433 nt、7495 nt、7852 nt,变异方式分别为碱基插入、碱基替代及碱基缺失突变;L1的变异部位分别位于6169～6171 nt、6901～6902 nt、6949～6951 nt,其变异方式为碱基替代、碱基插入及碱基缺失突变;E6的变异部位位于350 nt,其变异方式为碱基替代突变.结论:中国山西襄垣地区妇女宫颈癌患者组织中HPV16型病毒HPV16Z基因结构与德国标准株HPV16基因之间存在一定的差异.
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阴道毛滴虫AP33基因克隆与序列分析
目的:阴道毛滴虫黏附蛋白AP33基因的克隆与序列分析.方法:提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其克隆到pUCm-T 载体进行PCR、酶切及测序分析,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927 bp.测序结果目的基因与阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-1、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-3、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-2分别具99%、97%和94%的同源性.结论:成功克隆出阴道毛滴虫AP33基因序列,与已公布的AP33序列有很高的同源性.这为今后该蛋白的原核表达和大量制备提供一定的基础.
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云南部分地区鼠类及媒介昆虫自然感染立克次体调查
目的 了解云南地区宿主动物和媒介自然感染立克次体的情况.方法 采用鼠夹和鼠笼捕鼠,采集鼠体表的恙螨和耕牛体表的蜱虫,对鼠脾脏、恙螨和蜱虫提取DNA,应用巢式PCR扩增立克次体groEL基因,基因序列测定后与其它已知序列进行同源性分析.结果 从410份样品中扩增出立克次体groEL片断19份(阳性率4.63％),其中恙虫病东方体(Ot)阳性率2.68％(11/410),斑点热立克次体(SFGR)阳性率1.22％ (5/410),莫氏立克次体(Rm)阳性率0.49％ (2/410),立克次体共生菌(Re)阳性率0.24％ (1/410).与其它已知序列进行同源性分析,检出11株Ot的相似性为93.6％ ～ 100％,分别与GenBank中已知立克次体序列的高相似性在96.1％～100％;检出5株SFGR相似性为92.1％～99.5％,分别与GenBank中已知序列的高相似性在98.9％～ 100％;检出Rm 2株,均与Wilmington株的相似性达100％;检出Re 1株,与Re(EU435143)的相似性高为98.9％.结论 云南地区宿主动物及媒介中存在多种立克次体感染,应加强立克次体病的监测与防制工作.
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云南临沧地区蜱种分子生物学鉴定及埃立克体基因序列分析
目的 了解云南临沧地区蜱虫种类及其自然感染埃立克体的情况.方法 采集耕牛体表寄生的蜱虫,经形态学鉴定和分组后,从蜱虫中提取DNA,应用PCR扩增蜱虫COⅠ基因以及埃立克体16S rRNA和groEL基因,并测序分析.结果 共采集到蜱虫42只,其中微小牛蜱38只占90.48％、血蜱4只占9.52％.将每种蜱的2只为1组,在21组样本中,检出COⅠ片断21份(检出率100％);在相同的4组样本中均检出埃立克体16S rRNA片断和groEL片断4份(检出率19.05％).基因序列分析,检出的COⅠ片断序列中有2份与澳大利亚pava血蜱(JX573136)的同源性高(89.3％),其余19份序列与马来西亚微小牛蜱B3的同源性高(99.5％);检出的4份16S rRNA片断序列完全一致,与美国查菲埃立克体Arkansas和埃文埃立克体Aa2FT349及中国北京查菲埃立克体BY-YQ-HME-O18株的同源性均为100％;检出的4份groEL 片断序列也完全一致,与日本埃立克体Yonaguni206株的同源性高均为93.9％.结论 经分子检测证实云南临沧地区耕牛体表微小牛蜱中存在一种类似日本Yonaguni206株的埃立克体感染,耕牛体表还可能寄生一种新的血蜱.
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阴道毛滴虫AP65基因克隆与序列分析
目的对阴道毛滴虫黏附蛋白AP65基因的克隆与序列分析.方法提取阴道毛滴虫总RNA为模板,根据GenBank中发表的阴道毛滴虫黏附蛋白AP65序列设计一对引物,经RT-PCR得到与预计大小相一致的PCR特异性产物,将其克隆到pMD-18T载体后测序,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析.结果目的基因片段长度为1 704 bp,其序列与阴道毛滴虫黏附蛋白AP65-3、阴道毛滴虫黏附蛋白AP65-2、阴道毛滴虫黏附蛋白AP65-1的同源性分别为97.2%、94.4%和86.7%.结论成功克隆出阴道毛滴虫AP65基因,与已发表的AP65-3序列的同源性高,本研究为进一步研究阴道毛滴虫的致病机理,寻求更好的阴道毛滴虫病防治方法奠定基础.
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云南省永善县恙虫病流行病学调查
目的 对云南省永善县恙虫病开展流行病学调查.方法 应用胶体金免疫试验对发热患者血清进行恙虫病东方体(Orientia tsutsugamsushi)IgG和 IgM抗体检测,采用夜夹法诱捕调查地区鼠类,用巢氏 PCR方法对鼠脾脏做groEL 基因片段扩增和基因序列分析.结果 2015年5-10月在永善县发现恙虫病患者34例,其中实验室确诊病例21例,临床诊断病例13例;主要发病于8月,占总病例数的32.35%;40—49岁年龄组发病多,占总病例数的32.35%;农民发病数多,占总病例数的79.41%;有焦痂或溃疡的病例占总病例数的94.12%,其中位于腹股沟多(占有焦痂或溃疡患者的31.25%);有皮疹的病例占总病例数的50.00%.在捕获的39 份黄胸鼠(Rattus flavipectus)脾组织样品中,恙虫病东方体groEL基因片段扩增阳性 9 份(阳性率 23.08%).groEL基因片段序列进化树分析显示本次检测到的 YSP30 株与的 HSB1、FAR1、UAP4 等Saitama型菌株的遗传进化关系密切,检测到的其余8株与 UT213、UT221、SH205等 Karp 型菌株的遗传进化关系密切.结论 血清学和分子生物学方法证实了永善县存在恙虫病疫源地,当地存在 Karp 和 Saitama相关的2种基因型恙虫病东方体.
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阴道毛滴虫aP33基因克隆及其表达载体的构建
目的研究阴道毛滴虫粘附蛋白AP33的基因结构特点并构建其表达载体.方法提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性克隆,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性分析.再将亚克隆与表达载体分别酶切并连接.结果阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927bp.ap33与国外已报道的3株T.vaginalis的ap33基因分别具99%、97%、94%的同源性.结论成功克隆出阴道毛滴虫ap33基因序列,与已公布的ap33序列有很高的同源性.构建获得PET-32a(+)-ap33重组质粒,可在原核中进一步表达特异性蛋白.
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中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白C表达载体的构建及序列分析
目的构建莱姆病螺旋体PD91菌株外膜蛋白C(OspC)的表达载体,克隆表达OspC以便用于莱姆病诊断研究.方法设计引物,用PCR从PD91扩增出ospC基因,定向克隆到表达载体PGEX-5X-1,构建重组质粒.通过PCR、酶切分析及序列测定等方法鉴定重组质粒.结果 ospC基因被正确克隆到表达载体PGEX-5X-1中.序列测定结果证实与国外已报道的ospC基因序列同源性在65%～92%.结论 OspC的编码基因在不同菌株间的同源性存在较大的差异.PGEX-5X-1-ospC重组质粒的成功构建,为我国莱姆病特异性诊断试剂的研究奠定了基础.
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郭霍原则与16S rRNA基因序列分析在确定病原微生物中的应用
19世纪郭霍提出了关于某种微生物是否是病原的理论,这一理论后来被称为郭霍原则.郭霍原则包括以下3点[1-2]:1.某种微生物在某种疾病的所有病人中存在,包括那些有疑问的以及发生病理改变的病人.
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T细胞受体基因VγI-Jγ重排检测在血液病中的临床意义
目的 本研究采用PCR联合单链构象多态性技术(single strand conformation polymorphism,SS-CP)分析检测TCRVγI-Jγ基因重排在常见血液病的中的表达,结合临床资料初步探讨TCRVγI-Jγ基因重排在常见血液病的中的表达差异和临床意义.方法 应用PCR对115例血液病的骨髓进行TCRVγI-Jγ基因重排检测,阳性者行SSCP分析.结果 (1)TCRVγI-Jγ基因重排在急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、急性非淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减小性紫癜、免疫相关性血细胞减少症和系统性红斑狼疮的阳性率分别为77.78%、71.43%、21.62%、33.33%、77.78%、66.67%、50.00%和100%.(2)急性淋巴细胞白血病部分缓解、完全缓解患者与初治患者积分有显著差异(P值分别为0.013、0.02).在SSCP中,TCRVγI-Jγ基因重排在不同血液病中表达不同,恶性肿瘤患者表现为单克隆带/有优势寡亚克隆带.非恶性肿瘤患者表现为无优势寡亚克隆带/多克隆带,两者差异显著(P<0.01).结论 (1)TCRVγI-Jγ基因重排检测对淋巴系统恶性肿瘤的诊断有辅助作用.(2)急性非淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征也存在TCRVγI-Jγ基因重排.(3)PCR-SSCP检测TCRVγI-Jγ基因重排对良、恶性血液病的鉴别有一定意义.
关键词： TCRVγI-Jγ重排基因 基因序列分析 恶性血液病 -
16SrRNA基因序列分析在临床血流感染和腹腔感染疑难菌株鉴定中的应用
血流感染是指各种病原微生物侵入血循环引起的一种严重全身感染性疾病, 可以通过释放毒素和代谢产物等引起全身感染、中毒和全身炎性反应, 甚至引起全身多器官功能障碍综合征.腹腔感染也是临床常见的一种感染,多由外伤、手术等原因造成病原体入腹腔而引起的感染性疾病,包括发生于腹膜腔和腹腔脏器的感染性疾病.
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16SrDNA序列分析技术在临床细菌鉴定中的应用进展
传统的细菌系统分类的主要依据足形态特征和生化反应,对于有些疑难菌、少见菌的鉴定往往雄以达到理想的鉴定效果二近代分子遗传学和分子生物学实验技术的迅猛发展使微生物学的分子鉴定成为了可能,其中包括G+C mol％含量测定、16SrRNA基因(16SrDNA)和16 ～ 23SrRNA基因序列分析等.原核生物16SrDNA是编码16SrRNA的基因部分,具有种属保守性.本文就16SrDNA序列分析技术在临床细菌鉴定巾的应用进展作一综述.1.16SrDNA的分子结构与特点细菌16SrDNA存在于所有细菌的染色体基因组,其特点为:(1)以多拷贝形式存在于细菌基因组中.(2)由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌共有.可变区具有属或种的特异性,可据此进行引物和探针的设计.(3)其为长度适巾的1542bpDNA序列[1].由于16SrDNA与细菌整个基因组相比,有高度的保守性且具有良好的时钟性质,有人将其称为细菌的"化石".同时几乎所有病原菌的16SrDNA测序均已完成,因此16SrDNA被选为细菌鉴定的新目标[2-3].
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北京市西城区2009年-2011年H3N2甲型流感病毒HA1基因特性分析
目的:了解2009年6月-2011年6月期间北京市西城区H3N2甲型流感病毒HA1基因的变异情况.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增分离到的H3N2甲型流感病毒HA1基因,对基因片段进行测序,获得的序列与WHO推荐的疫苗株进行基因进化特性分析.结果:HA1基因进化树分析表明2009年、2010年、2011年基本上分为三个分支,并且每个分支与当年的疫苗株都不在同一分支上；HA1氨基酸变异中,抗原决定簇约有10.6％发生了变化,受体结合位点194位有改变.结论:2009年-2011年北京市西城区分离到的H3N2亚型流感病毒的抗原性及基因特性发生了变化,这种变化与世界各地的变化趋势大体吻合.
关键词： H3N2甲型流感病毒 HA1基因 基因序列分析 -
天津地区夏季1例季节性H3N2亚型流感NA基因特异性分析
目的 分析1例天津地区夏季季节性H3N2亚型流感感染病例中NA基因的变异情况.方法 分离病毒毒株,提取核酸,经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增NA基因,获得的测序结果与中国地区各地毒株进行同源比对,使用生物信息软件绘制种系发生树,翻译后序列与WHO推荐的2014年-2015年疫苗株A/Texas/50/2012的NA氨基酸序列进行比对.结果 NA基因进化树分析表明,该毒株与2011年-2013年广东、杭州、中山等地区毒株集中于一支,与2014年-2015年疫苗株比对共有3个位点的氨基酸发生变化.该毒株未出现耐药位点的变异.结论 本次研究所分离毒株与2014年-2015年疫苗株比对,其NA基因有变异,但未发现耐药位点的变异.
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一例混合感染病例中季节性H3N2亚型流感病毒HA1和NA基因特异性分析
目的 了解一例新甲型H1N1和季节性H3N2亚型流感混合感染病例中季节性H3N2亚型流感病毒HAl和NA基因的变异情况.方法 分离病毒毒株,提取核酸经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增HA1和NA基因,获得测序结果与WHO推荐2009年-2014年各年的疫苗株和疫苗相似毒株同源比对,使用生物信息软件绘制种系发生树.结果 HA1基因进化树分析表明该毒株与2013年各地区筛选毒株集中于同一分支,与2013年-2014年疫苗株比对共有8个位点的氨基酸发生变化.NA基因与2013年-2014年推荐疫苗相似株同源性比对有2个位点氨基酸发生变化,未出现耐药位点的变异.结论 本次研究所分离毒株与2013年-2014年疫苗株和疫苗相似株比对其HA1和NA基因都有变异,并未发现耐药位点的变异.
