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2011-2014年青岛地区甲型H3N2流感病毒基因进化分析
目的 了解2011-2014年青岛地区人群甲型H3N2流感病毒流行株基因进化及抗原变异趋势.方法 选取2011-2014年间青岛地区流行的甲型H3N2流感病毒64株,提取病毒RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HA、NA、MP 3个基因片段,并进行序列测定,对各基因片段进行系统发育分析及基因和氨基酸位点变异分析.结果 HA进化树分析表明,甲型H3N2流感病毒基本上分为三大分支,并且每个分支与当年的疫苗株都不在同一分支上;HA1蛋白抗原决定簇共有8个位点发生了变化;NA蛋白酶活性中心及周围相关位点氨基酸组成保守,未检测到耐奥司他韦和扎那米韦的变异位点.M2蛋白均发生S31N突变.结论 2011-2014年青岛地区流行的H3N2流感病毒在持续不断地发生基因变异而产生抗原漂移;毒株全部为烷胺类药物耐药株,但对神经氨酸酶抑制剂敏感.
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输入性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变异分析
目的 分析口岸输人性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因特征及变异趋势,及早发现变异株.方法 选取广东口岸入境人员中检出的64份输入性甲型H1N1流感阳性样本,对其病毒NA基因进行核苷酸序列测定.与2009年甲型H1N1流感代表株A/California/04/2009/H1N1的NA基因序列进行对比,对甲型H1N1流感病毒的NA基因进化树、核苷酸序列同源性、氨基酸序列的变异及蛋白分子结构变化等进行分析.结果 NA基因进化树分为3个分支,其中2009年、2010年病毒聚集成簇位于分支1,2011年病毒则与部分2010年检出的病毒位于较远距离的分支2和3.检出的1例病毒NA氨基酸的抗原决定簇上发生Y155H的变异,部分病毒NA蛋白在42位点上新增了一个糖基化位点,在68、386位点出现了糖基化位点的缺失.氨基酸G41R、V106I、V241I、N248D、I365T、N369K等位点的变异较为显著,但未见耐奥司他韦病毒的出现.结论 甲型H1N1流感病毒NA基因已发生一定程度的变异.随着突变的不断积累,病毒极可能会通过改变其抗原性和耐药性,从而引起新的流行.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 NA基因 变异 输入性 分析 -
山东省甲型H1N1流感病毒病原学及基因特性研究
在2009～2010年监测年度开展甲型H1N1流感病毒学监测并进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况.采集了17126份发热患者的鼻、咽拭子标本,采用逆转录实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)进行核酸检测,其中甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性4004份,总阳性率为23.38%.对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序.利用DNAStar软件对序列进行同源性分析发现与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株HA、NA基因同源性分别为96.9%～99.3%和99.1%～99.6%;利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析发现,与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株有21个血凝素基因的氨基酸发生替换,其中11个氨基酸位点位于抗原决定簇区,一个糖基化位点发生改变;有16个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,一个糖基化位点发生改变;未发生神经氨酸酶蛋白275位H→Y的替换.结果显示山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变,所有病毒均对达菲类药物敏感.
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华东地区家鸭中N1亚型禽流感病毒NA基因的遗传进化分析
为了解华东地区家鸭内禽流感病毒的遗传进化情况,对2002～2006年分离自华东地区家鸭的3种主要N1亚型的禽流感病毒:2株H1N1、10株H3N1和14株H5N1,共26株病毒的NA基因进行了遗传进化分析.结果表明,华东地区家鸭中的N1亚型的禽流感病毒正处于不断进化状态中.14株H5N1禽流感病毒均在NA的茎部缺失20个氨基酸(49～68位),而其他N1亚型的禽流感病毒的NA都未见发生此缺失.H3N1病毒可能与H1N1病毒发生了NA基因的重排,但是目前还没有直接证据表明华东地区家鸭中H5N1禽流感参与了基因重排.
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抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒NA基因的变异
将LG1株H9N2亚型禽流感病毒在带有抗LG1株母源抗体的鸡胚中分4个独立系列连续传40代后,有3个系列从10～20代起在NA基因的#99位发生了可稳定遗传的碱基“G”到“A”的突变,并使氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸；有2个系列从20～30代起在#473位发生了可稳定遗传的由“A”到“G”的碱基突变,导致相应的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸,另一个传代系列在50代时也发生了同样的突变.在无抗体的鸡胚上的2个独立对照系列同样传了80代,在这2个位点没有发生突变,表明这2个突变与抗体的选择压相关.在抗LG1母源抗体阳性鸡胚的连续40代传代过程中,NA基因在有抗体组的四个传代系列碱基的非同义突变(NS)与同义突变(S)比为4.6(321/7),而在无抗体组NS/S比为2.0(16/8).有抗体组NS/S值显著高于无抗体组,也显示出抗体的选择压作用.
关键词： H9N2亚型禽流感病毒 HA基因 NA基因 抗体选择压 基因变异 -
利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签
本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定.通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签.通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法.基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性.通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签.本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定.
关键词： 焦磷酸测序 H7N9亚型禽流感病毒 NA基因 分子标签 -
宠物鸟H3N8亚型流行性感冒病毒NA基因分子特征性分析
虽然流行性感冒(流感)病毒的自然宿主是野生水禽类,作为宠物的雀形目鸟(Passeriformes)不代表流感病毒主要储存库[1-4,6,7],但Stallknecht和Shane 1988年对21 318份鸟的样品分析后发现,雀形目鸟中流感病毒的分离率占2.9%,表明雀形目鸟在流感病毒储存库中起着一定的作用.
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2016～2017年江苏省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因分子进化分析
本研究对2016～2017年江苏省23株人感染H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因分子进化特征进行分析,为更好的预防和治疗人感染H7N9禽流感病例提供科学依据.通过RT-PCR方法扩增23株病毒的HA和NA基因,采用Sanger测序法进行测序,序列分析采用Mega6.0等软件.结果显示:23株H7N9病毒的HA和NA基因与WHO新推荐的候选疫苗株A/Hunan/2650/2016同源性较高(HA基因核苷酸与推导氨基酸序列同源性分别为99.1％～99.4％,99.5％～100％;NA基因核苷酸与推导氨基酸序列同源性分别为97.7％～98.0％,98.2％～98.5％).23株病毒HA蛋白裂解位点序列均为PEIPKGR/GL,未出现多个碱性氨基酸,属于低致病性禽流感病毒分子特征.HA蛋白受体结合位点出现了G186V、Q226L、A134V氨基酸位点的变化,保留双受体结合特性.其中一株病毒A/Suzhou/88/2016的NA蛋白发生H276Y变异,表明对神经氨酸酶抑制剂产生抗性.2016～2017年江苏省禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因处于不断的点突变当中,提示我们需要加强对江苏省H7N9禽流感病毒进行持续的病原学监测.
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浙江省宁波市2014～2015年H3N2流行性感冒病毒HA1基因与NA基因特性分析
目的 分析2014 ～2015年宁波市H3N2流行性感冒(流感)的流行特征和流行株血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的变异情况.方法 选择宁波市2014 ～2015年流感流行期间分离的H3 N2代表株17株,进行HA1基因和NA基因扩增、测定,用DNAstar的MegAlign序列分析软件进行分析处理.结果 宁波市2014 ～ 2015年H3 N2流感毒株HA1基因的核苷酸长度均为987 bp,编码329个氨基酸;NA基因的核苷酸长度均为1 410 bp,编码469个氨基酸.2014年H3N2流感病毒HA1基因与2015年相比该区域有10 ～12个氨基酸位点存在差异,其中有5个氨基酸位点涉及HA1区3个抗原决定簇,在158 ～ 160位氨基酸上增加了一个糖基化位点;NA基因发生了6～8个氨基酸位点的替换,2015年与2014年相比在245 ～247位增加了一个糖基化位点.在基因进化树上2014年与2015年的流行株也都形成了独立的分支.结论 宁波市2014 ～2015年间H3N2流感病毒无论是HA1基因还是NA基因均产生了较大的变异,流感病毒的流行应与病毒的抗原性漂移有关.
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重庆市2011-2016年甲型H1N1流感病毒分离株NA基因变异分析
目的 研究重庆市2011-2016年甲型H1N1流感病毒株神经氨酸酶(NA)基因特征,为甲型H1N1流感病毒感染的监测和预防提供试验依据.方法 按分离时间及地点的不同选取43株甲型H1N1流感病毒,经RT-PCR扩增病毒NA基因片段并进行序列测定,进行核苷酸及氨基酸序列分析.结果 基于NA基因的进化树显示,2011-2016年的甲型H1N1流感病毒与疫苗株关系均较近.43株病毒之间的NA基因同源性较高,与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)的核苷酸同源性为97.9%~99.4%,氨基酸同源性为96.8%~98.9%.研究中大部分甲型H1N1病毒NA蛋白上都具有疫苗株NA蛋白具有的8个糖基化位点,但也有部分毒株增加42位(NQS)的糖基化位点,或者丢失386位的糖基化位点.结论 甲型H1N1病毒的NA序列变异情况逐年增加,但总体上来说,重庆地区大部分甲型H1N1病毒仍对达菲敏感;同时应加强耐药性监测,为制定应对甲型H1N1流感流行措施提供参考.
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2014-2017年盐城地区甲型H1N1流感病毒HA、NA基因变异分析
目的 研究盐城地区2014-2017年甲型H1N1血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)分子遗传进化特征.方法 将盐城地区2014-2017年流感监测哨点医院以及流感暴发点采集的流感样病例标本进行核酸、病毒分离检测,选取2014-2017年甲型H1N1毒株,采用一步法RT-PCR方法扩增HA1和NA基因,扩增产物经测序,采用相应的生物信息软件进行核苷酸和氨基酸位点变异及基因种系进化特征分析.结果 2014-2017年抽取的17株甲型H1N1毒株HA1和NA基因各自分支的聚类关系基本一致,分为4个进化分支.与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比,盐城地区毒株HA1基因编码区共涉及3个抗原表位(Ca、Sa、Sb)和6个抗原位点(K154R、S162N、K163Q、S185T、L191I、S203T)变异;受体结合位点220环中有3个位点(D222G/N、G223R和E224K)发生变异,190螺旋中涉及1个位点(L191I)的变异;2017年两株毒株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017、A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)增加了1个162NQS糖基化位点.抗原表位、受体结合位点、糖基化位点发生了一定程度变异,导致在基因层面上A/California/07/2009(H1N1)疫苗株产生的保护效果有限,而2017年分离的两株毒株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017和A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)与疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)具有较好的保护效果.17株分离株未发生NA蛋白酶活性位点以及耐药位点的变化,部分毒株NA基因编码糖基化位点有一定变化.结论 2014-2017年盐城地区流行的甲型H1N1毒株HA1和NA基因正逐渐发生变异,这些变异位点的积累很可能会导致流感病毒发生实质性的抗原性的漂移.
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一起甲型H1N1流感疫情病原检测及其HA与NA基因特性研究
目的 确认引起一起流感暴发疫情的病原,阐明该病原的血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)的特性.方法 疫情中早出现流感样症状病例的咽拭子样本用real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,采用鸡胚分离法进行病毒培养,选取两病毒分离株进行HA和NA核苷酸序列测定,并进行基因特性分析.结果 此次流感疫情是由甲型H1N1流感病毒引起的,其HA和NA基因均与参比毒株的HA和NA基因高度同源,NA基因没有发生H274Y突变.结论 本研究的甲型H1N1流感病毒分离株为疫苗亲本株和中国分离株的类似株,对神经氨酸酶抑制剂类药物(如达菲)敏感.
关键词： 甲型H1N1流感 Real-time RT-PCR HA基因 NA基因 -
2013年南京市甲型H1N1流感病毒NA基因的进化分析
目的:调查2013年南京地区新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的分子特征,了解NA基因的变异情况,分析NA基因进化特征.方法:提取18株新型H1N1流感病毒基因组RNA,RT-PCR扩增NA基因,测序并分析其遗传进化特征和重要功能位点.结果:2013年南京分离株与国内外推荐疫苗株NA基因高度同源,序列相似性达98.2％以上.18株分离株在进化树上分为2支,与国内疫苗株接近,与国际疫苗株存在一定的遗传距离;与国内外疫苗株相比,多个位点氨基酸发生变异;1株分离株的酶活性位点119位发生了变异;部分分离株糖基化位点也出现了增加和缺失的现象.结论:南京市2013年流行株与国内外疫苗株NA基因同源性仍然较高,疫苗依然有效.2013年后期的甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因累积了更多的变异,需加强监测.
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2015-2017年盐城市甲型H3N2流感病毒HA1、NA基因分子特征
目的 从分子流行病学角度对盐城市2015-2017年流行的甲型H3N2流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA) 基因的分子特征进行研究.方法 收集盐城市2015-2017年流感监测哨点医院以及流感爆发点采集的3 891例流感样病例标本进行核酸检测和病毒分离,从中筛选出20株经血凝抑制试验(hemagglutination inhibition,HI)验证为甲型H3N2亚型的毒株,采用反转录聚合酶链式反应方法扩增其HA1和NA基因并进行测序.结果 2015-2017年流行的20株甲型H3N2毒株HA1和NA基因各自分支的聚类关系基本一致.盐城市A/Jiangsu-YC/1474/2015、A/Jiangsu-YC/1725/2015两株分离株与疫苗株A/Switzerland/9715293/2013和A/Hongkong/4801/2014的进化距离较近,而其余18株分离株与国内部分省市相近年份毒株亲缘关系相近,并与疫苗株A/Switzerland/9715293/2013和A/Hongkong/4801/2014进化距离较远 该20株毒株HAl基因编码区抗原表位、受体结合位点和糖基化位点均发生了一定程度变异.从基因变异角度进行分析,疫苗株A/Switzerland/9715293/2013对盐城地区流感流行的保护效果要弱于疫苗株A/Hongkong/4801/2014.结论 2015-2017年盐城市流行的甲型H3N2毒株HAl和NA基因已逐渐发生变异,可能导致流感病毒发生实质性的抗原性漂移,降低与流感疫苗株的匹配度,减弱流感疫苗的保护作用.
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双碱基延伸法结合荧光偏振法快速检测新甲型H1N1耐药位点方法的建立
目的 建立一种利用双碱基延伸法与荧光偏振技术(Fluorescence polarization,FP)快速检测甲型H1N1流感病毒NA基因耐药突变位点的新方法.方法 从GenBank随机下载30条甲型H1N1的NA(neuraminidase)基因序列,通过MEGA分析,利用Primer Premier软件设计3条特异引物,其中一对引物通过RT-PCR用于扩增含有耐药位点H275Y的NA基因,第3条引物是应用双碱基延伸终止法与荧光偏振技术检测NA基因对达菲类药物耐药位点H275Y的突变情况,再随机选取50株甲型H1N1流感病毒进行检测,与测序结果进行比对,验证检测结果的准确性.结果 50株甲型H1N1流感病毒的NA蛋白第275位氨基酸均为组氨酸,未发生H Y的替换,在灵敏度与特异性方面,与传统的基因测序结果一致性均达100%.结论 本方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,能实现对耐药位点突变的快速、准确检测,可应用于与SNP相关疾病的快速分型和突变位点的实时监测和临床检测.
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宜春市2011年至2012年乙型流感病毒耐药基因分析
目的 分析宜春市2011~2012年B型流感病毒耐药基因位点,掌握其耐药情况,为临床治疗和疾病控制提供依据.方法 采集宜春市流感监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,选择分离到的16株B型流感病毒进行核酸提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因后进行基因序列测定,用DNAStar5.0,Mage3.1生物软件对测序结果进行分析处理,翻译出氨基酸序列,进行基因特性分析.结果 16株B型流感病毒NA区域核苷酸序列长度均为1140bp,编码380个氨基酸,所有毒株的NA蛋白催化活性位点和辅助位点均未发生氨基酸替换.结论16株毒株均对流感病毒神经氨酸酶抑制剂药物敏感,我们应该继续对流行株耐药情况进行检测.
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新余地区2013年-2015年H3N2、B型流感病毒NA基因特性分析
目的 对新余地区2013年-2015年H3N2、B型流感病毒神经氨酸酶(NA)进行基因特性分析,为流感防控和临床治疗提供科学依据.方法 随机选择分离到的H3N2、B型流感毒株进行核酸提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因后进行核苷酸序列测定,用DNAStar5.0,Mage5.0分子生物学软件对测序结果进行分析处理.结果 与疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)相比10株H3N2亚型分离株NA基因同源性均超过98.6%,但同源程度随时间跨度缓慢下降.在NA氨基酸序列上,所有H3N2分离株的二硫键位点和耐药相关位点均相同,分离株A/JiangxiYushui/1359/2015(H3)因在329位是苏氨酸(T),导致其糖基化位点和抗原决定簇与其它H3N2亚型毒株不完全相同.B-Yamagata系流感病毒中有60%(9/15)的毒株为BY-HA/BV-NA重配毒株;所有B型分离株NA蛋白的二硫键位点、糖基化位点和耐药相关位点均未发生改变,但NA抗原决定簇在两个谱系间差异较大.结论 新余地区2013年-2015年所有分离株NA基因与相应疫苗株同源性较高.在NA氨基酸序列上除分离株A/JiangxiYushui/1359/2015(H3)外,其余分离株二硫键位点、糖基化位点和耐药相关位点在同(亚)型内是一致的;抗原决定簇在H3N2分离株间也是相同的但在B型不同系谱间差异相当大.所有分离株仍然显示出对神经氨酸酶抑制剂(NAIs)敏感,应该持续监测其变化情况.
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江西省季节性A(H1N1)流感病毒的基因特点及耐药性分析
目的 分析江西省2005年-2009年季节性H1N1流感病毒M2以及NA基因的特点,掌握其耐药情况,为流感防控提供参考.方法 从江西省流感监测网中随机选择26株季节性A (H1N1)流感病毒,经核酸提取和one-step RT-PCR扩增M以及NA基因片段,双向序列测定,采用DNAStar 5.0和Mage 4.0序列分析软件分析M2以及NA基因特征以及耐药性位点.结果 除2005年分离的3株病毒和2009年分离的2株病毒的M2基因重要位点未发生变异外,其他21株病毒均发生了S31N的氨基酸替换;2009年的5株分离株均发生H274Y突变外,其他21株病毒NA蛋白催化活性位点和辅助位点均未发生氨基酸替换.结论 2005年分离株均对奥司他韦敏感,部分毒株对金刚烷胺类药物耐药;2006年-2008年的分离株对金刚烷胺类药物耐药,但对奥司他韦敏感;2009年的分离株均对奥司他韦耐药,部分毒株对金刚烷胺类药物也耐药,应加强流感病毒耐药性监测.
关键词： 季节性A (H1N1)流感病毒 M2基因 NA基因 耐药性 -
天津地区夏季1例季节性H3N2亚型流感NA基因特异性分析
目的 分析1例天津地区夏季季节性H3N2亚型流感感染病例中NA基因的变异情况.方法 分离病毒毒株,提取核酸,经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增NA基因,获得的测序结果与中国地区各地毒株进行同源比对,使用生物信息软件绘制种系发生树,翻译后序列与WHO推荐的2014年-2015年疫苗株A/Texas/50/2012的NA氨基酸序列进行比对.结果 NA基因进化树分析表明,该毒株与2011年-2013年广东、杭州、中山等地区毒株集中于一支,与2014年-2015年疫苗株比对共有3个位点的氨基酸发生变化.该毒株未出现耐药位点的变异.结论 本次研究所分离毒株与2014年-2015年疫苗株比对,其NA基因有变异,但未发现耐药位点的变异.
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一例混合感染病例中季节性H3N2亚型流感病毒HA1和NA基因特异性分析
目的 了解一例新甲型H1N1和季节性H3N2亚型流感混合感染病例中季节性H3N2亚型流感病毒HAl和NA基因的变异情况.方法 分离病毒毒株,提取核酸经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增HA1和NA基因,获得测序结果与WHO推荐2009年-2014年各年的疫苗株和疫苗相似毒株同源比对,使用生物信息软件绘制种系发生树.结果 HA1基因进化树分析表明该毒株与2013年各地区筛选毒株集中于同一分支,与2013年-2014年疫苗株比对共有8个位点的氨基酸发生变化.NA基因与2013年-2014年推荐疫苗相似株同源性比对有2个位点氨基酸发生变化,未出现耐药位点的变异.结论 本次研究所分离毒株与2013年-2014年疫苗株和疫苗相似株比对其HA1和NA基因都有变异,并未发现耐药位点的变异.
