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Gli1在胰腺癌细胞侵袭和迁移中的作用
目的 探讨脑胶质瘤相关癌基因-1(Gli1)在胰腺癌细胞侵袭和迁移中的作用及可能机制.方法 体外培养胰腺癌细胞株Capan-2,通过RNA干扰技术分别干扰Capan-2细胞中的Gli1、小鼠双微体基因2(MDM2)和p53基因的表达.应用实时定量(qRT)-PCR试验进行干扰效应的验证;通过细胞侵袭和迁移实验观察干扰Capan-2细胞中Gli1、MDM2和p53表达对胰腺癌细胞侵袭和迁移的影响.同时通过Western blot法检测干扰Gli1表达后,金属基质蛋白酶-9(MMP-9)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(pERK)及磷酸化蛋白激酶B(pAKT)在Capan-2细胞中表达的变化.采用配对t检验对实验数据进行统计学分析.结果 qRT-PCR试验结果显示,干扰Gli1、MDM2、p53表达后,其mRNA水平较仅加脂质体组和对照组相比分别下调了70.5％和74.5％、61.8％和65.3％、73.8％和78.2％.在p53野生型Capan-2细胞中,干扰Gli1表达后胰腺癌细胞侵袭(94±8)和迁移能力(143±8)较对照组(150 ±7,190±10)均明显减弱(=6.584,P=0.022;t=8.266,P=0.014);干扰MDM2表达亦降低了细胞的侵袭(实验组:85±12,对照组:138 ±6)和迁移能力(实验组:127 ±9,对照组:180±10)(t=5.097,P=0.036;t =4.860,P=0.040).然而,体外干扰p53基因表达后,Capan-2细胞的侵袭(153 ±11)和迁移能力(209±13)较干扰前(106 ±7,164±8)却明显增强(t=4.669,P=0.043;t=4.990,P=0.038).Western blot法检测结果显示,体外干扰Gli1表达后MMP-9蛋白表达水平下调,但pERK和pAKT蛋白水平表达无改变.结论 Gli1可能通过调控MDM2、p53及MMP-9的表达水平促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移.
关键词： 胰腺肿瘤 肿瘤侵润 肿瘤转移 脑胶质瘤相关癌基因-1 -
首选溴隐亭治疗侵袭性巨大泌乳素腺瘤的综合治疗
目的 观察首选溴隐亭治疗侵袭性巨大泌乳素腺瘤(IGPs)综合治疗的远期疗效.方法 符合IGPs诊断标准的患者34例,均首选溴隐亭进行治疗,其中11例同时配合放疗.服药期间根据肿瘤缩小后的残留部位、有无继续显著缩小、有无耐药等情况决定是否手术或立体定向放射外科治疗或二者联合应用.术后继续以小剂量溴隐亭维持治疗.结果 平均随访33.6个月,33例患者症状显著改善,1例放疗后视力改善不明显.肿瘤体积平均缩小91.4%,泌乳素平均下降约97.1%,睾酮下降、皮质醇功能低下分别由治疗前的17例、10例降至6例、6例.溴隐亭治疗期间出现脑脊液鼻漏2例,1例自行缓解,1例行经蝶、开颅联合入路切除肿瘤、修补瘘口;4例出现不同程度的耐药现象.结论 IGPs应首选药物治疗,部分患者仅通过药物治疗即可达到影像学上肿瘤消失的目的,大部分患者需辅助经蝶手术、立体定向放射外科治疗,可以明显缩短治疗时间、减少药物的用量甚至停药,但要慎行放疗.
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扩大经蝶窦入路切除侵袭性垂体腺瘤
目的 探讨采用扩大经蝶窦入路切除侵袭性垂体腺瘤的有效性和安全性.方法 根据鞍区显微解剖学研究结果,采用扩大经蝶窦手术入路治疗64例侵袭性垂体腺瘤.结果 肿瘤全部切除51例,次全切除13例.术后发生短暂性尿崩症26例,脑脊液鼻漏5例及急性腺垂体功能低下者1例,无死亡及颅内感染.8例患者术后给予放射治疗,6例予以溴隐亭治疗.随诊3个月至6年,未见肿瘤复发或继续生长.结论 采用扩大经蝶窦入路切除巨大或不规则鞍外生长垂体腺瘤时,肿瘤显露满意,全切除率高,无明显手术并发症,是一种安全、有效的方法.对于那些肿瘤切除不彻底的患者,术后应密切随访,必要时给予放射或药物治疗.
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组织因子表达对原发性结直肠癌侵袭及转移能力的影响
目的探讨组织因子(TF)表达在原发性结直肠癌侵袭及转移中的作用,分析TF对人类大肠癌HT-29细胞侵袭能力的影响.方法应用免疫组织化学染色法研究85例原发性结直肠癌和6例结直肠良性腺瘤标本TF表达情况,分析TF表达与肿瘤侵袭转移及预后的关系;利用构建有正义/反义TFcDNA的质粒pcDNA3.1/Zeo,以脂质体法转染HT-29细胞; 转染成功的HT-29细胞采用Western印迹分析检测TF表达水平并进行基质胶体外侵袭实验观察细胞侵袭能力的变化.结果85例结直肠癌标本中40例(47.1%)TF表达阳性,正常黏膜和结直肠良性腺瘤均为TF阴性表达;TF阳性表达与结直肠癌的浸润深度密切相关(r=0.895, P<0.01);TF阳性表达与结直肠癌的同时性(r=0.974, P<0.01)和异时性(r=0.963 ,P<0.01)肝转移均密切相关;Logistic回归表明TF表达为结直肠癌肝转移的影响因素(P<0.01),多因素回归分析表明TF表达是影响原发性结直肠癌预后的因素之一(P<0.01);转染了正义TFcDNA的HT-29细胞的TF表达水平较未转染的HT-29细胞升高,转染了反义TFcDNA的HT-29细胞的TF表达水平则降低;转染了正义TFcDNA的HT-29细胞的侵袭能力较未转染的HT-29细胞增强,转染了反义TFcDNA的HT-29细胞的侵袭能力则减弱.结论TF可能参与原发性结直肠癌侵袭及转移的生物学过程,其阳性表达可能作为患者术后肝转移的预测指标应用于临床,TF表达是影响原发性结直肠癌预后的因素之一; TF表达的改变可以影响人类大肠癌HT-29细胞的体外侵袭能力.
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经上颌骨翻转入路切除颅底侵入瘤
目的 探讨上颌骨翻转入路手术切除颅底侵入瘤的指征、手术要点及优缺点. 方法 自1998年11月～2001年8月,采用上颌骨翻转入路连续切除鼻咽颅底肿瘤27例,对临床资料进行回顾性总结. 结果 27例中鼻咽癌6例,鼻咽纤维血管瘤5例,鼻咽囊腺癌5例,神经鞘瘤2例,嗅神经母细胞瘤2例,脊索瘤2例,颞下翼腭窝低分化癌2例,颞下翼腭窝肉瘤2例,上颌窦癌1例.18例曾经1次或多次手术切除肿瘤后复发.侵犯颅内重要结构的17例.全部患者术中显露满意,肿瘤均得到肉眼全切除,无手术死亡,术后无偏瘫等严重并发症.本组患者术后随访2～33个月,平均随访16个月.其中2例分别于术后5、8个月死于肿瘤复发;2例于术后7、12个月局部复发;1例于术后11个月出现肺转移,现带瘤生存;其余患者恢复日常生活. 结论采用上颌骨翻转入路切除原发于颅底、翼腭窝的肿瘤及广泛侵犯颅底的其他鼻咽部肿瘤,具有显露充分,手术切除彻底的优点.
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59例肺腺鳞癌患者的病理特征对其外科手术后生存的影响
目的 观察外科手术治疗后肺腺鳞癌(adenosquamous carcinoma,ASC)患者的生存期,探讨肿瘤的病理特征对其预后的影响.方法 回顾性分析2000年1月至2012年6月59例ASC患者的临床资料.选择肿瘤亚型、生物学行为、病理分期等因素,应用SPSS17.0分析影响患者预后的因素.结果 59例ASC患者中位生存时间409天(13.6个月),1、3、5年生存率分别为59.9％、36.4％及31.2％.59例患者中52例病理标本行基因检测,11例EGFR突变阳性,阳性率为21.2％ (11/52),2例患者KRAS突变阳性,阳性率3.8％(2/52).Log-rank检验及Cox多因素分析,病理亚型、胸膜侵及情况、肿瘤分期及辅助放化疗与预后相关,为影响患者预后的独立影响因素(P＜0.05).结论 肺腺鳞癌患者预后差、生存率低,分析患者病理特征,对高危人群给予综合治疗是使其获得长期生存的关键.
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检测非小细胞肺癌病人外周血和骨髓中肿瘤细胞的临床意义
目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)外周血和骨髓中肿瘤细胞分子诊断的临床意义,以及二者相关性.方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对31例肺癌病人、10例肺良性病变者和8名健康人外周血、骨髓中MUC1基因 mRNA表达进行检测.结果 31例肺癌病人中10例检测到外周血中有MUC1 mRNA表达,检出率32.3%;7例骨髓中有表达,检出率22.6%;二者之间存在显著正相关(P＜0.05),且与肺癌组织学类型、细胞分化程度及P-TNM分期均存在密切关系(P＜0.05).而肺良性病变者和健康人中均未检测到MUC1 mRNA表达.结论肺癌病人外周血和骨髓中存在常规方法检测不出的肿瘤细胞;应用巢式RT-PCR法检测肺癌病人外周血和骨髓中MUC1 mRNA表达,可为制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据.
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肿瘤侵及胸腹部大血管的外科治疗
目的 总结侵及胸、腹部大血管的肿瘤治疗过程中血管外科技术的临床应用及其疗效.方法 2001年1月至2005年12月,23例病人因肿瘤侵及胸、腹部大血管而行血管成形或重建术.结果 行肿物根治性切除19例,切除率达82.6%;行姑息性切除术4例,切除率17.4%.全组无术中死亡,围术期并发症发生7例次,发生率30.4%.全组随访20例(86.9%),失访3例,长随访63个月.围术期死亡4例,病死率17.4%.截至2005年8月,全组术后生存40 d～59个月,生存48个月以上3例,36个月以上4例,24个月以上6例,12个月以上9例,6个月以上12例;通过影像学检查手段了解移植血管通畅程度、肿瘤复发和转移情况,2例人工血管血栓形成,其余病例均无并发症.结论 病例选择恰当,尽量行肿瘤根治性切除并进行大血管重建,可提高病人生存率和生活质量.
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早期子宫颈癌宫旁淋巴结的识别及其临床意义
目的 探讨早期子宫颈癌患者宫旁淋巴结(PLN)存在与否及其分布、转移规律,进而评估以生物染料法(亚甲蓝染色)结合标本的局部解剖识别PLN的临床价值.方法 选择接受广泛性子宫切除+盆腔淋巴清扫术治疗的早期子宫颈癌(临床分期Ⅰb～Ⅱa期)患者60例,术前在肿瘤周围的宫颈组织内注射1%亚甲蓝4 ml,术中检查有蓝染的淋巴结为前哨淋巴结(SLN).术后立刻对切除的子宫标本进行局部解剖,从宫旁软组织中分离出PLN送病理检查.结果 60例患者中,38例(63%)患者存在PLN,共检出PLN 95枚,PLN的平均直径为(0.46±0.24)cm.其中,57枚(60%)PLN位于阔韧带内,沿子宫动脉走向分布;另38枚(40%)分布于主韧带、骶韧带及膀胱宫颈韧带内.95枚PLN中,69枚(73%)因被亚甲蓝染色而易于识别,并被认定为宫旁组织内的SLN.60例患者中,12例(20%)患者共17枚PLN有转移,其中2例(3%)PLN是惟一的转移部位.对于78枚无转移的PLN中的36枚进行连续切片及免疫组化染色检查发现,3枚有微小转移灶.结论 PLN存在于大部分宫颈癌患者的宫旁组织内,且为肿瘤转移的好发部位,但极易被忽视.采用生物染料法结合细致的局部解剖可识别PLN.
关键词： 宫颈肿瘤 淋巴转移 前哨淋巴结活组织检查 肿瘤侵润 -
术前诊刮后病理分级和术中肉眼判断肌层浸润深度预测临床Ⅰ期子宫内膜样腺癌高危因素的准确性评价
目的 评价术前诊刮后病理分级和术中肉眼判断肌层浸润深度预测临床Ⅰ期子宫内膜样腺癌高危因素[即术前诊刮后病理分级为G,和(或)术中肉眼判断肌层浸润深度≥1/2]的准确性.方法 收集1999年1月-2008年12月在浙江大学医学院附属妇产科医院接受手术治疗的687例临床Ⅰ期子宫内膜样腺癌患者的临床病理资料,对术前和术中预测存在高危因素者实施腹膜后淋巴结切除术.以手术切除的子宫标本的病理诊断为"金标准",评价术前和术中预测高危因素的准确性,并分析其影响因素.结果 术前和术中预测临床Ⅰ期子宫内膜样腺癌存在高危因素需行腹膜后淋巴结切除术的敏感度为70.4%,特异度为80.2%,准确率为77.6%,假阴性率为12.0%,假阳性率为43.0%,阳性预测值为57.0%,阴性预测值为88.0%.单因素分析显示,临床Ⅰ期子宫内膜样腺癌患者的年龄、绝经与否、病灶大小、宫颈受累与否、淋巴结转移与否及子宫外转移与否明显影响术前和术中预测高危因素的准确性(P＜0.05);多因素分析显示,患者的年龄、病灶大小、淋巴结转移与否及子宫外转移与否足影响术前和术中预测高危因素的准确性的独立因素(P＜0.05).结论 术前诊刮后病理分级和术中肉眼判断肌层浸润深度预测临床Ⅰ期子宫内膜样腺癌需行腹膜后淋巴结切除术的町靠性较高;但预测其不需行淋巴结切除术的假阴性率较高,需结合患者的年龄、病灶大小及是否疑有淋巴结或子宫外转移综合判断.
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Ⅰa期子宫内膜癌腹腔镜手术与假性脉管浸润关系的探讨
目的 探讨Ⅰa期子宫内膜癌腹腔镜手术与假性脉管浸润(PVI)的关系.方法 收集2008年1月—2015年12月大连市妇幼保健院行手术治疗且临床病理资料完整的Ⅰa期子宫内膜癌患者共515例,根据手术途径的不同分为腹腔镜组332例(64.5%)和开腹组183例(35.5%),比较两组患者的脉管浸润[包括淋巴脉管间隙浸润(LVSI)和PVI]情况,回顾性分析两组患者PVI的镜下表现;随访截止至2017年2月,随访时间为12~105个月,分析LVSI和PVI患者的术后辅助治疗及预后情况.结果 (1)两组患者的脉管浸润情况:515例Ⅰa期子宫内膜癌患者中,脉管内见癌栓共75例,其中LVSI 52例、PVI 25例(其中2例LVSI和PVI并存).腹腔镜组、开腹组患者脉管内癌栓的发生率[分别为15.4%(51/332)、13.1%(24/183)]及LVSI的发生率[分别为9.6%(32/332)、10.9%(20/183)]分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05);但腹腔镜组PVI的发生率[6.3%(21/332)]明显高于开腹组[2.2%(4/183);χ2=4.377,P=0.036].(2)两组患者PVI的镜下表现:332例腹腔镜组患者中,21例为PVI,其中8例表现为外侧肌层中大的厚壁血管内存在肿瘤组织并伴有间质或有乳头样结构,13例表现为血管内的肿瘤组织呈游离状态;183例开腹组患者中,4例为PVI,其中3例表现为血管内的肿瘤组织呈游离状态,1例表现为管腔内的肿瘤组织伴有间质.(3)LVSI和PVI患者的术后辅助治疗及预后情况:随访期内,75例LVSI和PVI患者中,7例失访,66例无复发生存,2例术后5个月复发,分别于术后12、25个月死亡,此2例均为腹腔镜组PVI患者,病理类型为低分化子宫内膜样腺癌,术后未接受辅助治疗;LVSI及PVI患者的中位无复发生存时间分别为49、46个月.结论 腹腔镜手术增加了Ⅰa期子宫内膜癌PVI的发生,但不增加LVSI,目前尚不能证明PVI影响患者预后.
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嗜神经侵袭对早期子宫颈癌患者预后的影响
目的：探讨嗜神经侵袭（PNI）在早期（Ⅰa2～Ⅱb期）子宫颈癌患者中的发生情况及对预后的影响。方法选择2007年1月至2012年12月，在四川省肿瘤医院妇瘤科接受子宫广泛性切除+盆腔（或加腹主动脉旁）淋巴结切除术，病理诊断为早期子宫颈癌的238例患者，镜下观察子宫颈及宫旁组织是否存在PNI现象，明确早期子宫颈癌患者不同临床病理指标与PNI发生的关系，并分析影响患者预后的因素。结果238例早期子宫颈癌患者中，发生PNI 22例，发生率为9.2%（22/238）。其中，Ⅰa2～Ⅱa2期210例，发生PNI 18例，发生率为8.6%（18/210）；Ⅱb期28例，发生PNI 4例，发生率为14.3%（4/28），两者PNI发生率比较，差异无统计学意义（P=0.261）。早期子宫颈癌患者PNI的发生与肿瘤直径、间质浸润深度、宫旁浸润、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移明显相关（P<0.05）；而与年龄、临床分期、病理类型、病理分级以及手术切缘是否阳性无关（P>0.05）。单因素生存分析显示，早期子宫颈癌患者的无瘤生存时间（DFS）与肿瘤直径、间质浸润深度、宫旁浸润、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移、手术切缘阳性、PNI明显相关（P<0.05），而其总生存时间（OS）与间质浸润深度、宫旁浸润、手术切缘阳性、PNI明显相关（P<0.05）；在早期子宫颈癌患者中，PNI阳性患者的DFS和OS较PNI阴性患者均明显缩短，分别比较，差异均有统计学意义（P=0.002，P=0.008）。多因素生存分析显示，宫旁浸润、间质浸润深度是影响患者DFS和OS的独立因素（P<0.05），淋巴结转移仅是影响患者DFS的独立因素（P=0.024）；而PNI不是影响患者DFS或OS的独立因素（P>0.05）。结论早期子宫颈癌存在PNI现象，PNI的发生与肿瘤直径、间质浸润深度、宫旁浸润、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移明显相关，是影响患者DFS和OS的不良因素，可作为早期子宫颈癌术后选择辅助性放化疗的一个指标。
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Linc-ROR在高级别卵巢浆液性癌组织和细胞中的表达及其功能研究
目的：探讨基因间长链非编码RNA-重编码调控因子（Linc-ROR）在高级别卵巢浆液性癌组织和细胞中的表达，及其对高级别卵巢浆液性癌细胞生物学功能的影响。方法（1）收集2014年6月—2016年2月在青岛大学附属医院行手术治疗的34例高级别卵巢浆液性癌患者的癌组织标本，以同期19例因子宫肌瘤行子宫全切除+双侧附件切除术患者的正常输卵管伞端组织作为对照，采用逆转录（RT）-PCR技术检测其Linc-ROR mRNA的表达，并分析Linc-ROR mRNA表达与高级别卵巢浆液性癌手术病理分期、淋巴结转移的关系。（2）采用小分子干扰RNA（siRNA）靶向干扰卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3细胞中Linc-ROR mRNA的表达，实验分为4组，Linc-ROR-i组（转染Linc-ROR siRNA）、Linc-ROR-NC-i组（转染Linc-ROR siRNA的阴性对照siRNA）、Linc-ROR-p组（转染过度表达 Linc-ROR基因的重组载体pIRES2-EGFP-Linc-ROR质粒）、Linc-ROR-NC-p组（转染pIRES2-EGFP-Linc-ROR质粒的阴性对照质粒），采用RT-PCR技术检测4组SKOV3细胞中Linc-ROR mRNA的表达，活细胞计数（CCK-8）法、体外划痕实验和体外侵袭实验分别检测转染后4组SKOV3细胞的增殖情况以及细胞迁移、侵袭能力。结果（1）RT-PCR技术检测显示，高级别卵巢浆液性癌组织中Linc-ROR mRNA表达水平为4.31±0.38，明显高于正常输卵管组织中的1.03±0.21（t=25.842，P<0.01）；Linc-ROR mRNA的表达水平随着高级别卵巢浆液性癌手术病理分期的增高明显升高（F=95.702，P<0.01），且有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者（t=7.397，P<0.01）。（2）RT-PCR技术检测显示，Linc-ROR-i组细胞中Linc-ROR mRNA的表达水平明显低于其阴性对照Linc-ROR-NC-i组（分别为0.30±0.11、1.02±0.10；t=15.269，P<0.01）；Linc-ROR-p组细胞中Linc-ROR mRNA的表达水平明显高于其阴性对照Linc-ROR-NC-p组（分别为8.90±0.45、1.03±0.17；t=21.934，P<0.01）。CCK-8法检测显示，细胞培养3 d后（包括培养3、4、5、6 d），Linc-ROR-i组细胞各时间点的增殖能力[以吸光度（A）值表示]均明显低于其阴性对照Linc-ROR-NC-i组，Linc-ROR-p组细胞各时间点的A值均明显高于其阴性对照Linc-ROR-NC-p组，分别比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。体外划痕实验检测显示，培养48 h后，Linc-ROR-i组细胞的迁移率明显低于其阴性对照Linc-ROR-NC-i组[分别为（52±4）%、（67±5）%；t=5.720，P<0.01]；Linc-ROR-p组细胞的迁移率明显高于其阴性对照Linc-ROR-NC-p组[分别为（84±4）%、（66±4）%；t=7.330，P<0.01]。体外侵袭实验检测显示，培养48 h后，Linc-ROR-i组的侵袭细胞数为（74±3）个，明显低于其阴性对照Linc-ROR-NC-i组的（104±3）个（t=15.810，P<0.01）；Linc-ROR-p组的侵袭细胞数为（217±4）个，明显高于其阴性对照Linc-ROR-NC-p组的（108±5）个（t=38.060，P<0.01）。结论高表达Linc-ROR能够增强高级别卵巢浆液性癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力， Linc-ROR可能是导致高级别卵巢浆液性癌发生、发展和侵袭、转移的重要分子之一。
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乙酰肝素酶与绒毛膜癌侵袭能力的关系
目的 通过研究乙酰肝素酶(Hpa)在绒毛膜癌高、低侵袭力细胞系及正常早孕绒毛组织中的表达情况,探讨Hpa与绒毛膜癌侵袭能力的关系.方法 通过Matrigel体外侵袭实验检测不同侵袭力绒毛膜癌细胞系JEG-3和JAR的体外侵袭能力;应用免疫细胞化学方法及蛋白印迹法(western blot)检测Hpa蛋白在不同绒毛膜癌细胞系及正常早孕绒毛组织中的表达,并进行相关性分析.结果 (1)JEG-3细胞的穿膜细胞数[(191±17)个]较JAR细胞的穿膜细胞数[(106±13)个]明显增多,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(2)Hpa蛋白在绒毛膜癌细胞JEG-3、JAR中均有表达,且主要定位于细胞质.(3)在正常早孕绒毛组织、JEG-3细胞和JAR细胞中均可检测到Hpa蛋白,JEG-3细胞中Hpa蛋白的表达量(1.560±0.180)明显高于JAR细胞Hpa蛋白的表达量(0.610±0.170),绒毛膜癌细胞系中Hpa蛋白的表达量又显著高于正常早孕绒毛组织Hpa蛋白的表达量(0.190±0.008),两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(4)相关性分析显示,Hpa蛋白的表达量与绒毛膜癌细胞体外侵袭能力呈正相关关系(r=0.89,P＜0.05).结论 Hpa蛋白在绒毛膜癌细胞中表达较正常绒毛组织高;Hpa蛋白在滋养细胞中的表达随滋养细胞侵袭能力的增加其表达上调;滋养细胞产生过量的Hpa对基底膜蛋白的水解作用在绒毛膜癌的侵袭、转移中发挥重要作用.
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RNAi技术沉默子宫颈癌HeLa细胞中HPA基因的表达对细胞侵袭力的影响
目的 利用RNA干扰(RNAi)技术沉默宫颈癌细胞系HeLa细胞中乙酰肝素酶(HPA)基因的表达,并探讨其对宫颈癌细胞侵袭力的影响.方法 根据GenBank数据库提供的HPA基因核苷酸序列,设计4对针对HPA基因的短发夹状RNA(shRNA)特异性寡核苷酸序列(即shRNA-HPA-592、shRNA-HPA-995、shRNA-HPA-1351、shRNA-HPA-1658),并设计1条随机无关序列作阴性对照,分 别克隆到pYr-1.1质粒中.用脂质体法将上述质粒转染入HeLa细胞,以未转染质粒者为空白对照,采用逆转录(RT)-PCR技术、免疫荧光法分别检测转染后HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白的表达,筛选出其中对HPA基因沉默效果佳的质粒.将该质粒转染入HeLa细胞,采用穿膜(transwell)小室体外侵袭实验检测转染后HeLa细胞侵袭力的变化.结果 RT-PCR技术检测显示,转染shRNA-HPA-592、shRNA-HPA-995、shRNA-HPA-1351、shRNA-HPA-1658质粒后,HeLa细胞中HPA mRNA的表达水平分别为0.54±0.05、0.89 ±0.18、0.82±0.22、0.91 ±0.47,阴性对照和空白对照细胞中HPAmRNA的表达水平分别为1.31 ±0.72和1.09±0.16；免疫荧光法检测显示,转染上述不同质粒后HeLa细胞的胞质中均可见绿色荧光,HPA蛋白均呈阳性表达,其中转染shRNA-HPA-592质粒后HeLa细胞的胞质中绿色荧光强度弱.故筛选出的对HPA基因沉默效果佳的质粒即为shRNA-HPA-592质粒.体外侵袭实验检测显示,转染shRNA-HPA-592质粒后HeLa细胞的穿膜细胞数为(44±4)个,明显低于空白对照、阴性对照[分别为(182±6)、(258±17)个],差异有统计学意义(P＜0.01)；而阴性对照与空白对照比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 本研究成功筛选出了靶向HPA基因的shRNA表达质粒,转染宫颈癌HeLa细胞后可高效抑制其HPA基因的表达,明显降低宫颈癌细胞的侵袭力,为进一步研究HPA基因的表达与宫颈癌侵袭的机制奠定了基础.
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缺氧条件下沉默Rab11基因的表达对子宫颈癌细胞系SiHa细胞侵袭和迁移能力的影响
目的：通过观察缺氧条件下沉默Rab11基因对子宫颈癌细胞系SiHa细胞侵袭和迁移能力的影响，并探讨其可能的作用机制。方法实验分为4组：缺氧Rab11干扰组（缺氧状态下转染siRNA）、缺氧阴性干扰组（缺氧条件下转染空白无干扰意义的siRNA）、缺氧空白组（缺氧条件下培养）、常氧空白组（常氧条件下培养）。蛋白印迹法检测4组SiHa细胞中Ras相关蛋白11（Rab11）、整合素α5、整合素β3、磷酸化局部黏着斑激酶（p-FAK）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）及Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）的表达水平；实时荧光定量PCR技术检测4组SiHa细胞中Rab11 mRNA的表达水平；体外侵袭实验检测4组SiHa细胞的侵袭能力；体外迁移实验检测4组SiHa细胞的迁移能力；免疫荧光法检测4组SiHa细胞中Rac1蛋白的表达。结果（1）蛋白印迹法检测显示：①缺氧Rab11干扰组中SiHa细胞Rab11、整合素α5、整合素β3、p-FAK、p-PI3K、Rac1蛋白的表达水平分别为0.44±0.03、0.30±0.03、0.29±0.03、0.30±0.03、0.30±0.03、0.34±0.04；②缺氧阴性干扰组分别为0.72±0.03、0.73±0.03、0.59±0.03、0.61±0.03、0.59±0.03、0.72±0.03；③缺氧空白组分别为0.73±0.03、0.74±0.03、0.61±0.03、0.62±0.03、0.60±0.03、0.73±0.03；④常氧空白组分别为0.56±0.04、0.33±0.03、0.33±0.03、0.36±0.03、0.35±0.03、0.47±0.03。（2）4组SiHa细胞中Rab11 mRNA的表达水平，缺氧Rab11干扰组为0.570±0.046，缺氧阴性干扰组为1.442±0.101，缺氧空白组为1.454±0.114，常氧空白组为1.000±0.000。（3）4组SiHa细胞侵袭至小室下层的细胞数分别为，缺氧Rab11干扰组（50±11）个，缺氧阴性干扰组（104±17）个，缺氧空白组（106±16）个，常氧空白组（65±12）个。（4）4组SiHa细胞迁移的数量分别为，常氧空白组（127±12）个，缺氧空白组（169±15）个，缺氧阴性干扰组（161±13）个，缺氧Rab11干扰组（77±13）个。（5）免疫荧光法显示4组SiHa细胞核中周围分布有红色荧光，为Rac1蛋白的定位表达。以上检测指标的比较结果均为：缺氧Rab11干扰组<常氧空白组<缺氧阴性干扰组<缺氧空白组；缺氧Rab11干扰组的结果较缺氧空白组、缺氧阴性干扰组均明显降低（P<0.05）；而缺氧空白组的结果与缺氧阴性干扰组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；缺氧空白组的结果较常氧空白组明显升高（P<0.05）。结论缺氧促进子宫颈癌细胞系SiHa细胞的侵袭、迁移；缺氧时，Rab11蛋白下调能够抑制SiHa细胞的侵袭、迁移，其机制可能与整合素α5、整合素β3、p-FAK、p-PI3K及Rac1蛋白表达水平下降有关。
关键词： 宫颈肿瘤 细胞系 肿瘤 rab GTP结合蛋白质类 rac1 GTP结合蛋白质 肿瘤侵润 细胞运动 缺氧 -
Bcrp1+表型子宫颈癌HeLa细胞侵袭及成瘤能力的研究
目的 通过对宫颈癌细胞系HeLa细胞中Bcrp1+表型细胞的侵袭和成瘤能力的研究,探讨Bcrp1成为宫颈癌干细胞表面标志物的可能性.方法 根据实验中所用HeLa细胞表型的不同分为两组,即Bcrp1+组和Bcrp1 -组,利用穿膜小室——boydon小室体外侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力；将不同细胞密度梯度(1×104、1×105、1×106个/ml)的Bcrp1+及Bcrp1-组细胞分别接种于6～8周龄非糖尿病-严重免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内,比较两组小鼠的体内成瘤情况,包括成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积及肿瘤质量.结果 体外侵袭实验显示,Bcrp1+组穿膜细胞数为(99± 14)个,侵袭深度为(366±52) μm,明显高于Bcrp1-组的(57±13)个和(301±54) μm,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).体内成瘤实验显示,接种细胞密度为1 ×104个/ml时,Bcrp1+ 组小鼠体内即可形成移植瘤；接种细胞密度为1×105和1×106个/ml时,Bcrp1+组和Bcrp1-组小鼠体内均可形成移植瘤；与Bcrp1-组小鼠比较,Bcrp1+组小鼠接种相应细胞密度的成瘤时间早、成瘤率高、肿瘤体积和肿瘤质量大,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Bcrp1+表型的HeLa细胞与Bcrp1-表型相比,具有较强的成瘤及侵袭能力,具备肿瘤干细胞的部分特征,其中可能富集了宫颈癌干细胞.
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PPARγ基因表达对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响
目的 探讨过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)基因表达对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响.方法 选取子宫内膜癌细胞系ECC-1(ER阳性)及KLE(ER阴性)细胞,分别转染PPARγ基因表达载体(PPARγ载体组)及PPARγ小分子干扰RNA(siRNA)质粒(PPARγsiRNA组),以转染无义序列siRNA(siRNA无义序列组)、空载体(空载体组)者为阴性对照,以只加入脂质体者(空白对照组)为空白对照.转染48 h后,实时逆转录(RT)-PCR技术及蛋白印迹法(western blot)检测细胞中PPARγmRNA及蛋白表达水平的变化;western blot检测细胞中Wnt信号传导通路中关键蛋白——β连接素(β-catenin)及髓细胞增生原癌基因编码蛋白(C-myc)蛋白表达水平的变化;体外迁移、侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力的变化,活细胞计数(CCK-8)法检测细胞增殖能力[以吸光度(A)值表示].结果 转染48 h后,实时RT-PCR技术和western blot检测显示,PPARγ载体组ECC-1及KLE细胞中PPARγ mRNA(分别为5.18 ±0.99、4.54±0.89)和蛋白(分别为1.45±0.12、1.30±0.13)的表达水平升高,β-eatenin(分别为0.44 ±0.06、0.46±0.04)、C-myc(分别为0.42±0.08、0.30±0.11)蛋白表达水平降低,PPAR γ siRNA组ECC-1及KLE细胞中PPAR γ mRNA(分别为0.48 ±0.08、0.53±0.11)和蛋白(分别为0.41±0.04、0.49±0.05)的表达水平降低,β-catenin(分别为1.18±0.12、0.89±0.07)、C-myc(分别为0.91 ±0.08、0.77 ±0.12)蛋白的表达水平升高,分别与siRNA无义序列组、空载体组、空白对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).体外迁移、侵袭实验检测显示,PPAR γ载体组ECC-1、KLE细胞的迁移细胞数[分别为(129±9)、(119±9)个]及侵袭细胞数[分别为(63±12)、(68±16)个]减少,PPARγ siRNA组ECC-1、KLE细胞的迁移细胞数[分别为(201±14)、(170±11)个]及侵袭细胞数[分别为(142±9)、(138±7)个]增多,分别与siRNA无义序列组、空载体组、空白对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).CCK-8法检测显示,PPARγ载体组ECC-1、KLE细胞的A值(分别为0.66±0.14、0.78 ±0.06)均低于siRNA无义序列组、空载体组、空白对照组,PPARγ siRNA组ECC-1、KLE细胞的A值(分别为1.42±0.16、1.23±0.04)均高于siRNA无义序列组、空载体组、空白对照组,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 上调PPARγ基因表达可抑制子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭及增殖,而下调PPARγ基因表达可促进子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭及增殖.
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槲皮素以及槲皮素联合顺铂对子宫颈癌细胞黏附、迁移和侵袭的影响
目的 探讨槲皮素以及槲皮素联合顺铂对宫颈癌细胞黏附、迁移和侵袭的影响.方法 以不同浓度(20、40、80 μmol/L)槲皮素以及槲皮素联合顺铂(10 μmol/L)处理宫颈癌细胞株HeLa细胞,采用细胞黏附实验、划痕实验和穿膜小室侵袭实验分别检测处理前后HeLa细胞黏附率、迁移速度以及侵袭力(以穿膜细胞数表示)的变化.结果 不同浓度的槲皮素处理后,随着槲皮素浓度从20 μmol/L增加至80 μmol/L,细胞黏附率由(82.2±1.5)%降至(48.4±1.1)%;细胞迁移速度由(7.26±0.20)μm/h降至(3.78±0.64)μm/h;穿膜细胞数由(124.3±1.5)个降至(90.7±2.1)个,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).顺铂联合槲皮素处理后,随着槲皮素浓度从20 μmol/L增加至80 μmol/L,细胞黏附率由(42.6±1.2)%降至(27.5±1.7)%;细胞迁移速度由(2.20±0.33) μm/h降至(0.72±0.19) μm/h;穿膜细胞数由(78.7±2.5)个降至(44.0±4.0)个,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).槲皮素联合顺铂处理后对HeLa细胞黏附、迁移和侵袭的抑制作用明显强于单纯槲皮素处理者(P<0.05).结论 槲皮素以及槲皮素联合顺铂能抑制HeLa细胞黏附、迁移及侵袭,槲皮素能增强顺铂对HeLa细胞黏附、迁移及侵袭的抑制作用.
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酪氨酸激酶受体B介导的卵巢上皮性癌OVCAR3细胞失巢凋亡抑制与其侵袭的关系
目的 探讨失巢凋亡抑制因子酪氨酸激酶受体B(TrkB)介导的卵巢上皮性癌(卵巢癌)OVCAR3细胞的失巢凋亡抑制与其侵袭的关系.方法 采用RT-PCR和实时定量PCR技术检测4种细胞包括3种不同病理类型的卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3(两者均为卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系)和ES2(卵巢透明细胞癌细胞系)细胞及神经母细胞瘤细胞系sK-N-DZ细胞中,以及经不同方式[贴壁培养和立体培养(培养后形成团簇细胞)]培养的OVCAR3细胞中TrkB mRNA的表达.转染TrkB小分子干扰RNA(siRNA)后,流式细胞仪检测OVCAR3细胞的凋亡率,以转染无意义的(scrambled)siRNA者为阴性对照;体内、体外侵袭实验检测不同方式培养的OVCAR3细胞的侵袭能力.结果 (1)OVCAR3细胞中TrkB mRNA表达水平为0.0240±0.0017,明显高于SKOV3细胞的0.0030±0.0006、ES2细胞的0.0027±0.0009及SK-N-DZ细胞的0.0087±0.0003(P＜0.01);OVCAR3团簇细胞中TrkB mRNA表达水平为0.0437±0.0021,明显高于贴壁细胞的0.0240±0.0017(P＜0.01).(2)转染TrkB siRNA后,OVCAR3细胞的凋亡率为(46.3±5.9)%,明显高于阴性对照的(9.0±0.8)%(P＜0.01).(3)体外侵袭实验显示,OVCAR3团簇细胞的穿膜细胞数为(71.8±0.8)个,明显多于贴壁细胞的(47.7±0.8)个(P＜0.01);体内侵袭实验显示,转染TrkB siRNA后,OVCAR3细胞在裸鼠体内形成的肿瘤体积为(6.0±1.4)mm3,明显小于阴性对照的(16.3±4.7)mm3(P＜0.01).结论 TrkB可能通过诱导卵巢癌OVCAR3细胞的失巢凋亡抑制而赋予其高侵袭能力.
