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膜蛋白双向电泳技术在软骨细胞相关研究中的应用
目的 探索应用双向电泳技术研究人类关节软骨细胞膜蛋白蛋白组学的可行性及膜蛋白双向电泳与总蛋白电泳技术的互补性.方法 取材膝关节软骨组织,应用Ⅱ型胶原酶/透明质酸酶DMEM溶液消化法分离软骨细胞,分别提取总蛋白和膜蛋白,进行双向电泳研究,观察膜蛋白所生成2-DE电泳凝胶的图像质量,并对比膜蛋白与总蛋白双向电泳凝胶图像之间蛋白点分布的差异和互补性.结果 膜蛋白双向电泳可获得较高质量的电泳图像,每张胶图可识别412.3±13.5个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH5.0-9.0的偏碱性区域.总蛋白双向电泳凝胶可识别564.31±5.9个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH3.0-7.0的偏酸性区域.结论 软骨细胞膜蛋白双向电泳可产生高质量的凝胶图像,其分离蛋白质的等电点分布区域与总蛋白双向电泳技术形成互补,可为软骨细胞为样本的相关疾病病因学研究提供更多的信息.
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海马组织分区膜质分离后亚蛋白质组分析方法的建立
目的建立适合研究膜质分离后海马组织不同分区亚蛋白质组的实验方法.方法显微切割获得成年大鼠海马不同解剖分区,然后按溶解性不同使用顺序抽提法细胞质和细胞膜蛋白,双向电泳进行分离蛋白后,采用与质谱兼容的高敏感银染显示蛋白斑点,经专业图像软件分析处理评价电泳效果.结果海马各个分区组织中膜蛋白得到有效富集,其中海马齿状回富集效率达8倍,图谱中可以显现的总蛋白斑点数目比传统方法增多30%.结论建立了理想的海马组织分区亚蛋白质组图谱,对膜蛋白实现了有效的富集,可以用于研究不同解剖分区在蛋白水平上的差异,为学习记忆、中枢神经缺血缺氧性损伤等多种后继研究提供了平台.
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金黄地鼠腹侧前列腺在体修饰精子膜蛋白作用研究
[目的]在整体水平探讨前列腺分泌蛋白对金黄地鼠精子膜蛋白的影响.[方法]雄性鼠手术分为4组,分别为附属性腺全去组,腹前列腺摘除组,去除其他附属性腺仅保留腹前列腺组和假手术组,每组动物6只.收集与保留前列腺及去除组的雄性鼠交配后的子宫腔精子,抽提精子膜蛋白,膜蛋白经聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)和二维电泳凝胶分析,比较前列腺存在与否精子膜蛋白组分的异同.[结果]与不同组雄鼠交配后收集的子宫腔精子膜蛋白SDS-PAGE电泳谱主要条带类似.含腹前列腺组的精子膜组分中相对分子质量15 k、29 k、38 k、55 k和91 k多肽的量较去除腹前列腺组的子官腔精子膜相应组分增加.二维电泳结果示与含腹前列腺组雄鼠交配后收集的子宫腔精子膜蛋白较无腹前列腺组的精子膜蛋白多出10个蛋白斑点(MM/IP分别为16k/8.60、16.5k/9.2、28k/5.88/6.10、29k/5.98、32k/6.35/6.50/7.20、61k/5.90、83k/6.40),另外蛋白斑点量增加有11个.[结论]腹前列腺可修饰和调节精子膜蛋白,进而这些蛋白可能对雄性生殖力及胚胎的发育起作用.
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烧伤休克大鼠外周血白细胞表面LFA-1及其配基表达的变化
目的 探讨烧伤性休克时白细胞表面LFA-1，ICAM-1的表达情况。方法 以烧伤休克大鼠为模型，用单克隆抗体间接免疫荧光标记法测定白细胞表面LFA-1，ICAM-1的表达。结果 烧伤后2 h白细胞表面LFA-1，ICAM-1表达无明显变化。在烫伤后5 h，多形核粒细胞表面LFA-1，ICAM-1表达有下降趋势但无统计学意义(P＞0.05)；而单核白细胞表面LFA-1表达量明显下降(P＜0.05)，ICAM-1始终无变化。结论 烧伤后白细胞表面LFA-1与ICAM-1表达量随着休克进展而呈下降趋势，尤以LFA-1为明显，说明白细胞表面LFA-1表达量与休克不同时期相关联，而ICAM-1表达变化与LFA-1不同。
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气道上皮中pendrin蛋白的研究进展
Pendrin蛋白也称为可溶性转运家族26A4(solute carrier familly26A4, SLC26A4),是SLC26A家族成员之一,SLC26A 是一组阴离子转运蛋白,包括presin(存在于内耳的蛋白),先天性高氯性腹泻(congenital chloride diarrhea)者缺乏此类蛋白.由于pendrin 蛋白与其他硫转运因子具有同源性, 故以往认为它是一硫酸盐转运子,后来的研究[1]证实主要是一种碘/氯转运子,以一个完整的膜蛋白形式存在,主要转运类似碳酸氢盐、碘化物和氯化物等阴离子[2].
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骨膜蛋白对心脏重构的作用及其机制
骨膜蛋白在心脏重构的病理进程中表达增加,但对其上游调节与下游作用的内在机制尚未达成共识.本文以骨膜蛋白对心脏重构的影响的研究进展为重点,分析研究分歧.介绍作用机制,展望其研究及临床应用前景.
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Robo4膜蛋白的功能研究进展
Robo为保守单跨膜受体蛋白，是一种神经黏附分子，包括 Robo1、Robo2、Robo3、Robo44个家族成员。 Robo 蛋白在神经系统中的导航作用已被公认。Robo4又名 Magic Roundabout，是新近发现的 Roundabout 家族成员，因其特异性表达于内皮细胞而得名。 Robo4与家族的其他成员相比，具有结构的特殊性和表达的特异性。近发现 Robo4在多个系统中发挥着重要作用，但其功能及具体机制尚不明确。
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GP73、可溶性GP73与肝脏疾病的研究进展
近年来,学者发现Ⅱ型高尔基体膜蛋白(GP73,golgi protein 73)在各种肝脏疾病中出现高表达,尤其是在肝癌患者当中表达明显升高,诊断肝癌具有比AFP更高的敏感性,有可能成为早期肝癌的血清标志物.而sGP73(soluble GP73),即血清中可溶性GP73,分子量较GP73稍小,被认为是从完整的GP73分子上释放出来的部分结构域[1].现将GP73、可溶性GP73与肝脏疾病的研究进展做一综述.
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一价阴离子交换蛋白家族与相关疾病
阴离子交换蛋白(anion exchanger,AE)是一种多功能的嵌膜蛋白,初在红细胞膜上鉴定,主要功能是转运一价阴离子,生理条件下以极快速率进行Cl-/HGO3-交换,从而维持细胞内外离子平衡和适pH内环境,此外还具有调节红细胞携氧能力、锚定膜骨架蛋白、维持红细胞特有盘状双凹面形状和变形性等重要功能.目前至少已发现3种AE基因家族成员,分别是AE1、AE2、AE3,位于第17、7、2号染色体上.它们广泛分布于机体的组织和器官,具有重要的生理功能,异常的AE还与诸多疾病的发生、发展相关,目前对AE的研究日益受到临床医学上的重视.
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心肌缺血及再灌注过程中的膜损伤与膜修饰
生物膜是由多种脂质、蛋白质、碳水化合物和离子组成的超分子体系,它是生命活动的重要结构基础.膜脂是构成生物膜的基本骨架,主要起结构作用,并可通过其流动性和极性作用调节蛋白质功能. 膜脂主要由磷脂、糖脂和类固醇组成,而磷脂在生物膜,尤其是在动物膜体系中的含量较高. 膜脂的组分和构型对维持膜蛋白的构象,表现其活性有着重要的作用 [1].
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拉莫三嗪与丙戊酸钠对Ⅰ型钠离子通道Nav1.1膜蛋白表达的影响
目的 比较Ⅰ型钠离子通道NaV1.1在拉莫三嗪(LTG)及丙戊酸钠(VPA)处理后的蛋白表达水平,探讨LTG和VPA参与癫痫治疗的可能机制.方法 构建带YFP标签的NaV1.1蛋白表达载体(pCMV-YFP-SCN1A),转染HEK293T细胞.使用LTG、VPA处理24 h,提取总蛋白和生物素标记的膜蛋白,采用Western blotting检测NaV1.1总蛋白及膜蛋白的表达水平.结果 与对照组比较,NaV1.1膜蛋白表达水平在VPA处理24 h后显著增加(P<0.05),而在LTG处理24 h后无显著改变(P>0.05);NaV1.1总蛋白表达水平在LTG、VPA处理24 h后无明显变化(P>0.05).结论 VPA可促进NaV1.1膜蛋白表达,可能是参与抗癫痫治疗过程的潜在机制.
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伯氏疏螺旋体广西分离株外膜蛋白A基因的克隆和序列分析
目的探求广西伯氏疏螺旋体外膜蛋白A(OSPA)基因变异情况.方法应用聚合酶链反应从3株广西莱姆病螺旋体GXLD-4,9,18及1株贵州分离株长14全基因组DNA中将OSPA基因调出,并克隆到pGEM-Teasy Vector载体上,构建重组质粒,测序后与国外其它分离株进行同源性比较.结果4株莱姆病螺旋体均扩增出约774bp的OSPA基因,编码258个氨基酸.4者之间核苷酸同源性98.8%～99.9%,氨基酸同源性98%～99%,其中GXLD-4与长14同源性大.与国外分离株(10MT,Ya501)的同源性均较高.结论莱姆病螺旋体OSPA基因在广西3个分离株及贵州株长14间差异较小,但与国外分离株存在一定差异.
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具有广谱中和活性的HIV感染者血浆病毒膜蛋白基因及中和特征分析
目的 分析一例具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白(Env)基因序列特征及中和特征.方法 使用单拷贝基因组扩增(SGA)方法从患者两个随访时间点血浆样本扩增env基因,测序后进行序列比对和进化树构建,分析env基因特征;将env基因克隆至pcDNATM3.1载体上,env质粒和骨架质粒pSG3△env共转染293T细胞制备假病毒,使用假病毒分别和两个时间点的自体血浆及6种不同的广谱中和抗体进行中和试验,分析Env蛋白的中和特征.结果 从两个时间点血浆样本中共获得50个全长env基因,进化分析显示两个时间点序列各自聚集成簇,第1个时间点膜蛋白序列有较短的V1区和较少的V1区糖基化位点数目,第2个时间点膜蛋白序列有更高的基因多样性.自体血浆不能中和同时期的假病毒,但能中和前期的假病毒;两个时间点的假病毒对PGT121、PGT135、2G12和10E8抗体均高度敏感,但对V RC01及12A21抗体呈现中和抗性.结论 该具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白基因持续进化;感染者体内存在CD4bs类中和抗体的免疫压力.
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HIV-1广谱中和活性感染者假病毒的中和表型分析
目的 分析HIV-1广谱中和活性感染者基于膜蛋白基因(env)的假病毒对自体血浆和代表性广谱单克隆中和抗体(bmNAbs)的中和表型.方法 单基因组扩增(SGA)广谱中和活性感染者第0月血浆的env基因并克隆至pcD-NATM3.1 Directional TOPO表达载体,将env表达质粒与HIV-1骨架质粒pSG3△env共转染293T/17细胞制备假病毒,用假病毒分别与自体连续时间点血浆和代表性bmNAbs进行中和实验分析中和表型.结果 共获得11株功能性假病毒,假病毒对8个连续时间点自体血浆的中和敏感性呈现先升高(第0～15月),后下降(第16～32月),之后再上升(第33～45月)的波动.所有假病毒对10E8、PGT121和VRC01中和敏感(IC50＜6 μg/mL);各有18.2％(2株)的假病毒对12A21和2G12高度敏感(IC50＜1μg/mL);所有病毒均对PGT135呈中和抗性.结论 假病毒对当前时间点血浆的中和敏感性低,对之后时间点血浆中和敏感性增强,提示感染者体内病毒与中和抗体的动态进化过程.同一时间点假病毒对特定bm-NAbs的敏感性差异明显,提示感染者准种毒株间中和表型的复杂性.
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钩端螺旋体膜蛋白研究进展
问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)在全球分布广泛,危害极大,已发现25个血清群,273个血清型.钩体病是世界上流行广的人兽共患病之一[1],人体感染后,轻者似感冒,重者可有明显的肝、肾、肺及中枢神经系统损害,甚至死亡.
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小鼠主动脉平滑肌细胞 Robo4膜蛋白的提取
目的：优化小鼠主动脉平滑肌细胞膜蛋白提取方法，获得高纯度的Robo4膜蛋白。方法高速离心法选择性地分离提取总膜蛋白，BCA法测定总膜蛋白含量，Western-Blot检测目的蛋白条带。结果成功提取总膜蛋白，总膜蛋白浓度达1．47μg/μL ，Western-Blot检测出Robo4膜蛋白条带。结论该提取方法简单、可靠、快速，获得的膜蛋白纯度高，可用于Western-Blot后续试验。
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P-糖蛋白介导药物相互作用的细胞模型研究概况
P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是由多药耐药蛋白1(Multidrug resistance 1,MDR1)基因编码的能量(ATP)依赖性膜蛋白,可发挥外排泵作用,将细胞内的化合物逆浓度梯度转运至胞外.
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细胞膜表面标志CD系列抗体蛋白芯片制备及应用的研究
目的本研究利用抗原抗体免疫反应的原理,研制一种可同时快速检测多种蛋白的蛋白芯片,用于细胞膜表面抗原的检测.方法将抗细胞表面标志CD抗原的CD系列抗体蛋白固定在醛基玻片上形成微阵列,从样品细胞中抽提膜蛋白抗原并用FSE标记, 然后与固定在芯片上的CD抗体阵列反应,扫描仪检测反应结果.结果本研究选用HL-60,K562,NB4,Jurkat细胞株为代表,测定到细胞膜表面蛋白质CD抗原HL-60、K562、NB4、Jurkat细胞CD13均为阳性,HL-60、NB4、Jurkat细胞CD4阳性,NB4 细胞CD38阳性,K562细胞CD7阳性.所得结果与免疫印迹及免疫组织化学验证等方法一致.结论 HL-60,K562,NB4,Jurkat细胞膜表面蛋白质CD抗原有差异.蛋白芯片方法具有的高信息通量、低成本、制备、测定快速简单的优点,展示了良好的应用前景.
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不同组织膜蛋白及二甲基亚砜对小脑颗粒细胞突起生长的影响
目的探讨不同组织膜蛋白提取物和二甲基亚砜对大鼠小脑颗粒细胞(CGC)突起生长的影响.方法提取成年大鼠肝、坐骨神经和脑白质的组织膜蛋白包被盖片,接种CGC于盖片上,同时将二甲基亚砜(DMSO)作为添加剂加入培养液,观察CGC突起的生长.结果①脑白质膜蛋白能明显抑制CGC突起的生长,随浓度增加抑制效应更加明显;坐骨神经膜蛋白对CGC突起生长抑制不明显,肝组织膜蛋白则能促进突起生长;②随DMSO浓度升高CGC突起生长逐渐受到抑制,当DMSO浓度小于1%时,CGC突起长度与对照对照差别不大.结论脑白质膜蛋白对CGC突起生长有明显抑制作用,而DMSO添加到培养液中在低浓度时不会显著影响神经元突起生长,可用于检测药物及疏水性分子对体外培养的神经细胞突起生长的作用.
关键词： 小脑颗粒细胞(CGC) 膜蛋白 二甲基亚砜(DMSO) 突起生长 -
神经突触前递质小泡胞吐作用的分子机制
神经系统突触小泡的胞吐作用(exocytosis)关系到神经内分泌物质及神经递质的释放.其机制一直是神经科学界关注的问题之一.近年来由于分子生物学手段的进展对于此问题的研究取得了很大成就,分离出许多与此机能有关的蛋白质,它们参与小泡的胞吐过程.
