首页 > 文献资料
-
靶向重组腺病毒载体研究进展及其在肿瘤基因治疗中的应用
腺病毒载体已经广泛应用于肿瘤的基因治疗临床试验,然而某些组织和细胞表面缺乏或低表达其相应的受体,使得腺病毒不能有效感染并发挥作用.研究新型重组腺病毒载体使之特异性感染靶器官,降低对正常组织的损伤,已成为肿瘤基因治疗研究的热点.靶向基因治疗可通过靶向性导入和靶向性基因表达调控等策略来达到.本文介绍了重组腺病毒载体系统靶向改造及在肿瘤基因治疗应用方面的新研究进展.
关键词： 腺病毒 靶向基因治疗 柯萨奇病毒腺病毒受体 肿瘤 -
VEGF基因治疗靶向载体的构建及其特异性表达分析
目的:构建KDR启动子介导的VEGF逆转录病毒载体pLXSN-D299-KDRp-VEGF165,并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析.方法:将逆转录病毒载体3'LTR的U3区缺失299个碱基使其自身启动子失活,然后重组pLXSN-D299-KDRp-VEGF165载体.经PA317细胞包装,NIH3T3细胞测定其病毒滴度.用高病毒滴度细胞株产生的病毒上清分别感染ECV304人脐静脉血管内皮细胞和NIH3T3细胞,收集细胞培养上清经ELISA和western Blot分析.结果:VEGF165在内皮细胞ECV304中的表达量明显高于NIH3T3细胞.结论:构建的pLXSN-D299-KDRp-VEGF载体,可在内皮组织细胞中特异性地表达VEGF.
-
靶向性溶瘤腺病毒对肝癌细胞的特异性杀伤研究
目前颇为看好的一类恶性肿瘤基因治疗方案是溶瘤腺病毒介导的癌细胞裂解疗法.针对肝细胞癌(HCC)的特异性溶瘤腺病毒(带甲胎蛋白启动子)多表现出对AFP阳性HCC细胞的选择性裂解.尽管占总数30%～40%的AFP阴性HCC细胞内仍有痕量的AFP启动子活性[1],但这些HCC特异性溶瘤腺病毒对其均无杀伤作用.
-
壳聚糖纳米粒介导的人类端粒酶反转录酶启动子连接的自杀基因耦联更昔洛韦靶向抗肝癌研究
目的 比较壳聚糖(Ch)与半乳糖化壳聚糖(GC)纳米载体对肝癌细胞的转染效果;观察转染后的人类端粒酶反转录酶启动子连接的自杀基因(pGL3-hTERTp-TK)对肝癌细胞株HepG2生长及凋亡的影响.方法 制备Ch及GC;构建pGL3-hTERTp-TK质粒及Ch/DNA和GC/DNA复合物;转染HepG2细胞和正常肝细胞L-02;通过单光子液闪计数仪观察转染效率;流式细胞术(FCM)、Caspase-3方法 观察自杀基因对肝癌细胞生长和凋亡的影响.结果 质粒经酶切及电泳后在琼脂糖凝胶上出现300 bp与1100 bp两个清晰条带;在HepG2中,由GC介导的pGL3-hTERTp-Luc+荧光素相对活性表达明显高于Ch介导的pGL3-hTERTp-Luc+,但比去唾液酸糖蛋白(AF)介导的pGL3-hTERTp-Luc+低,而在正常肝细胞荧光素相对活性表达极低;治疗质粒GC介导的pGL3-hTERTp-TK转染的HepG2细胞抑制率和L-02细胞抑制率,在前体药物更昔洛韦(GCV)的浓度为10 μg/ml时差异有统计学意义(t=51.40,P=0.000).HepG2细胞组GC-pGL3-hTERTp-TK凋亡率为65.28%,明显高于其他组(LSD法,均P＜0.05).L-02细胞组GC-pGL3-hTERTp-TK凋亡率仅为10.80%,明显低于对照组Ch-pGL3-control (LSD法,P=0.000);FCM检测显示Ch-pGL3-hTERTp-TK转染HepG2细胞后其平均荧光强度为168.02±3.68,GC-pGL3-hTERTp-TK转染后其平均荧光强度为204.45±3.45,两组差异有统计学意义(t=-12.504,P＜0.05).结论 GC较Ch能提高pGL3-hTERTp-TK质粒对肝癌细胞的转染率,GC-pGL3-hTERTp-TK可以靶向攻击肝癌细胞,对止常肝细胞几乎无影响.
-
急性淋巴细胞白血病靶向基因治疗的研究进展
目的：探讨急性淋巴细胞白血病靶向基因治疗的研究进展。方法120例急性淋巴细胞白血病患者，随机分成对照组和实验组，各60例。实验组使用靶向基因治疗，对照组采取常规方法，对比两组的治疗效果。结果实验组显效35例，有效20例，无效5例，总有效率为91.67%；对照组显效8例，有效12例，无效40例，总有效率为33.33%。实验组总有效率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向基因治疗对于急性淋巴细胞白血病患者预防和减少并发症的发生，促进患者康复和缩短住院时间有一定积极意义。
-
抑制端粒酶活性引起肝癌细胞凋亡的caspase机制探讨
目的 本文探讨hTERTp-TK/GCV系统诱导HepG2细胞凋亡的caspase分子机制.方法 hTERTp-TK/GCV转染HepG2,免疫印迹技术检测caspase-3,8,10,survivin活化裂解情况;MTT法检测caspase-8,3,10抑制剂对hTERTp-TK/GCV诱导HepG2细胞调亡的抑制作用.结果 免疫印迹技术结果显示随时问延长,caspase-8、3酶原逐渐减少、活化片断增多,caspase-10酶原无明显改变,survivin则逐渐减少;caspase-8抑制剂能明显抑制hTERTp-TK/GCV系统诱导的肝癌细胞凋亡,其抑制作用大于caspase-3抑制剂.结论 hTERTp-TK/GCV系统诱导的肝癌细胞凋亡主要是激活了细胞凋亡死亡受体途径上游的caspase-8引起的,同时还涉及caspase家族其它成员,caspase-10没有参与此调亡过程,此外还涉及survivin的活性减少.
-
表皮生长因子受体介导的肿瘤靶向基因治疗的一种新策略
目的建立一种针对表皮生长因子受体(EGFR)富集的恶性肿瘤进行靶向基因治疗的方法.方法构建重组真核表达载体pcDNA3.1-PEⅢmut.将组蛋白H1亚基与表皮生长因子C环(H1-EGFc)融合蛋白作为非病毒载体,与pcDNA3.1-PEⅢmut在体外形成复合物.以此蛋白质-DNA复合物分别处理EGFR富集的BT-325和Hela细胞以及EGFR缺乏的JK细胞,并在处理48 h后计算该蛋白质-DNA复合物对各细胞的杀伤率.结果含3 μg DNA的H1-EGFc与pcDNA3.1-PEⅢmut复合物对EGFR富集的BT-325和Hela细胞的杀伤率分别是46.03%和48.12%,但对EGFR缺乏的JK细胞无杀伤作用.结论成功建立了针对EGFR富集恶性肿瘤的靶向基因治疗方法.
-
卵巢癌靶向基因治疗研究进展
卵巢癌死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤之首,基因治疗是治疗卵巢癌的一种新手段.卵巢癌的靶向基因治疗能提高对肿瘤细胞的杀伤作用而不影响正常细胞,是目前研究的热点.载体是基因治疗的关键.目前应用的载体系统主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体.利用卵巢癌的特殊启动子和靶向基因可以提高基因治疗的靶向性.卵巢癌靶向基因治疗的方法主要有:分子化疗、RNA干扰、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗和联合基因治疗.卵巢癌的靶向基因治疗目前尚处于临床前实验阶段.
-
卵巢癌的靶向基因治疗研究进展
分子生物学和免疫学的发展为卵巢癌基因治疗研究提供了理论基础和技术方法,卵巢癌的靶向基因治疗以其准确性高、不良反应轻成为近年研究热点.载体是基因治疗的关键,载体主要包括病毒载体和非病毒载体,各有其优点及局限性.利用卵巢癌特殊启动子和潜在的候选靶向基因可提高卵巢癌基因治疗的靶向性.卵巢癌基因治疗方法包括自杀基因治疗、RNA干扰、多向耐药基因治疗、联合基因治疗等,均处于临床试验中.
-
pcDNA3.1(+)/hTERT-tk真核表达质粒的构建及其在HepG-2细胞中的表达
目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对肝癌HepG-2细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/hTERT-tk,用脂质体法分别转染肝癌细胞(HepG-2)和正常肝细胞(L-02)后给予更昔洛韦(GCV),用TUNEI,法观察自杀基因对肝癌细胞生长的影响.结果:HETRT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对肝癌HepG-2细胞有明显的杀伤作用,而对正常肝细胞则作用不明显.结论:hTERT-tk/GCV基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,有靶向治疗肝癌的潜力.
-
靶向基因治疗恶性肿瘤的临床应用
近年来,肿瘤细胞的靶向杀伤治疗已成为肿瘤治疗的发展趋势,利用单抗、细胞因子或基因等靶向杀死肿瘤细胞是肿瘤靶向杀伤策略研究的重要进展,已成为恶性肿瘤可能治愈的手段.本文主要对急性淋巴细胞白血病、卵巢癌、肝癌、宫颈癌、胃癌、前列腺癌近年来的一些新的靶向基因治疗作一综述.
-
hTERT启动子的克隆及在胃癌细胞中的转录活性研究
目的:克隆人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)核心启动子,研究hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和正常人成纤维细胞HLF中的转录活性.方法:以Hela细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT核心启动子片段,将其克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建hTERT-pGL3Basic表达载体.将该载体用脂质体转染法转染SGC7901和HLF细胞,检测hTERT启动子在这两种细胞中的转录活性.结果:成功克隆hTERT核心启动子;双酶切和PCR鉴定均显示hTERT-pGL3Basic表达载体构建成功;荧光素酶活性检测显示hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的21.5%,而在HLF细胞中无活性.结论:hTERT启动子具有肿瘤特异性,可以用于肿瘤的靶向基因治疗.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 克隆 靶向基因治疗 胃癌 -
hTERT-TK/GCV对肝癌细胞生长及凋亡的靶向性影响
背景与目的:自杀基因治疗肿瘤已初见成效,引起了许多研究者的关注,端粒酶有希望成为肝癌基因治疗的理想靶点.本研究探讨hTERT-TK/GCV在体外对肝癌细胞生长及凋亡的靶向杀伤作用及机制.方法:体外细胞培养,构建荧光报告质粒和治疗质粒,脂质体瞬时转染方法将质粒导入肝癌细胞,荧光显微镜,流式细胞仪,原位末端标记等方法观察转染质粒对肝癌细胞生长及凋亡的影响,用Western blot检测hTERT-TK对肝癌细胞周期调控因子cyclinD1、Cdk2、p21蛋白表达的影响.结果:hTERT-TK可以高效、特异的转染表达端粒酶活性的肝癌细胞HepG2,并使其凋亡,总的凋亡率可达64%,而正常肝细胞L-02的凋亡率仅为15%,几乎不影响正常肝细胞的生长.结论:hTERT-TK/GCV自杀基因系统具有靶向抗肝癌作用,有潜在临床应用前景.
-
磁性纳米颗粒Fe3O4@PEI介导靶向自杀基因联合磁流体热疗对肝癌移植瘤的抑制作用
目的:探讨磁性纳米颗粒Fe3O4@PEI介导靶向自杀基因联合磁流体热疗对肝癌移植瘤的特异性杀伤作用.方法:亚克隆基因重组法构建靶向肝癌的自杀基因p[HRE]AFP-HSVTK和肿瘤细胞成像报告基因载体p[HRE]AFP-Luc,并用限制性内切酶凝胶电泳法检测重组质粒是否构建成功.共沉淀法制备Fe3O4纳米粒并以聚乙烯亚胺(PEI)修饰后得到磁性纳米颗粒Fe3O4@PEI,将其作为肿瘤基因治疗的载体和磁流体热疗的介质,并利用透射电镜、粒径仪、傅里叶转换红外光谱等对Fe3O4@PEI进行表征鉴定.利用小动物活体成像仪检测Fe3O4@PEI系统运送报告基因p[HRE]AFP-Luc至荷瘤裸鼠后的生物发光信号.p[HRE]AFP-HSVTK/Fe3O4@PEI作用于肝癌细胞后,以MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测凋亡细胞比例,动物实验验证体内肿瘤生长速度及瘤体质量抑制效果,并用透射电镜分析肿瘤组织的亚细胞结构.结果:成功构建磁性纳米颗粒Fe3O4@PEI以及重组载体p[HRE]AFP-HSVTK和p[HRE]AFP-Luc,经尾静脉注射Fe3O4@PEI运送的p[HRE]AFP-Luc后,活体成像系统显示仅能在裸鼠肿瘤组织检测到明显的成像信号,其主要器官病理组织分析无明显病理损伤.在体外肿瘤细胞杀伤试验中,联合治疗组细胞增殖抑制率分别高于磁流体热疗组和基因治疗组[(76.02±7.33)％ vs (42.31±4.28)％、(47.76±4.8 1)％,均P＜0.05],联合治疗组瘤细胞的凋亡率高于单独热疗组和基因治疗组[(34.05±3.41)％ vs (14.41±1.55)％、(11.64±1.20)％,均P＜0.01].体内治疗实验显示,联合治疗组移植瘤体积增长明显减慢甚至下降,瘤块质量显著小于其他单独治疗组(P＜0.05);瘤块细胞亚结构出现明显的凋亡形态.结论:自杀基因p[HRE]AFP-HSVTK对肝癌细胞具有选择性杀伤作用,Fe3O4@PEI可以作为有效的基因治疗载体和磁流体热疗的介质,其介导的肝癌靶向治疗联合磁流体热疗能特异地抑制肝癌移植瘤.
-
p[5HRE] AFPp-p53/PEI-Fe3O4磁性纳米颗粒联合磁流体热疗对肝癌细胞的抑制作用
目的:建立p[5HRE] AFPp-p53/PEI-Fe3O4磁性纳米颗粒靶向基因治疗和磁流体热疗系统用于肝癌的联合治疗,以提高治疗的安全性和有效性.方法:亚克隆基因重组法构建靶向肝癌的治疗基因p[5 HRE] AFPp-p53,并用限制性内切酶凝胶电泳法检测重组质粒是否构建成功;用共沉淀法制备磁性纳米颗粒PEI-Fe3O4,利用透射电镜、粒径仪、傅里叶转换红外光谱仪等对PEI-Fe3O4进行表征检测.MTT法检测PEI-Fe3O4转染p[HRE] AFPp-p53至不同细胞系后的细胞增殖及磁流体热疗和基因治疗联合作用对肝癌细胞HepG2的增值抑制作用.结果:成功制备载有靶向治疗基因的p[5HRE] AFPp-p53/PEI-Fe3O4磁性纳米颗粒,由其介导的基因治疗组与阴性及纳米颗粒对照组相比,明显抑制肝癌HepG2(AFP阳性)细胞[(0.592 ±0.041) vs (1.052 ±0.031)、(1.012-±0.021),P＜0.01]和SMMC7721(AFP阴性)细胞(0.813 ±0.042) vs(1.073±0.032)、(1.182±0.052),P＜0.01]的增殖活性,但对非肝癌细胞(L929和Lovo)增殖抑制作用无明显影响(P＞0.05).基因治疗和磁流体热疗联合组与单独使用热疗组及基因治疗组相比显著增加HepG2细胞的增殖抑制率(76.11％ vs 35.22％、42.92％,均P＜0.01).结论:p[5HRE] AFPp-p53/PEI-Fe3O4磁性纳米颗粒对肝癌细胞具有特异性杀伤作用,并且能与磁流体热疗产生协同效应,是一种选择性高、治疗效果好的肿瘤治疗方法.
-
腺病毒介导microRNA-99a过表达抑制肝癌细胞生长
目的:利用腺病毒介导microrRNA-99a( miR-99a)的过表达,观察miR-99a对肝癌细胞生长的抑制作用,探讨一种腺病毒介导miRNA治疗肿瘤的新方法.方法:qRT-PCR检测正常肝细胞系L-02和肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Hep3B和Huh7细胞中miR-99a的表达,构建含miR-99a的重组5型腺病毒Ad5-miR-99a.用空载腺病毒Ad-blank和Ad5-miR-99a分别感染Huh7细胞,MTT法和集落形成实验检测miR-99a过表达对Huh7细胞生长的抑制作用.结果:与正常肝细胞L02和其他肝癌细胞相比,miR-99a在肝癌Huh7细胞中表达量相对低(P＜0.01).成功构建重组腺病毒Ad5-miR-99a,Ad5-miR-99a感染Huh7细胞后,miR-99a可在Huh7细胞中稳定高表达.集落形成实验和MTT实验显示,相对于Ad-blank组,Ad5 -miR-99a可显著抑制Huh7细胞的生长和集落形成(P＜0.01).结论:成功构建重组腺病毒Ad5-miR-99a,miR-99a能有效抑制肝癌细胞的增殖,Ad5-miR-99a有可能成为治疗肝癌的新药物.
-
靶向肝癌表达p16基因的腺病毒载体对裸鼠移植瘤的抗癌活性
目的:利用已构建好的在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体AdAFP-p16,研究腺病毒介导p16基因的表达对肝癌裸鼠移植瘤的抗癌活性.方法:培养肝癌细胞SMMC-7721,于裸鼠右侧腹部近腋下皮肤注射1×106细胞数细胞悬液,建立裸鼠肝癌移植瘤模型.成瘤后给于瘤体内AdAFP-p16病毒注射治疗,病毒总量1×109 pfu/只,观察AdAFP-p16对肝癌模型的抗肿瘤疗效以及p16基因表达引起的肝癌细胞病理变化.结果:AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,具有明显的肿瘤生长抑制作用,抑制率可达60.12%(P＜0.01),引起肝癌细胞的坏死.结论:AFP启动子控制的p16基因在肝癌细胞中定向表达,能够抑制肝癌模型的生长,对肝癌综合治疗具有重要意义.
-
卵巢特异性启动子的研究进展
卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率居第三位，病死率居首位，尽管通过手术和化疗后要达到临床和血液生化指标完全缓解，但是多数晚期患者仍会在2～3年内复发，终结果是化疗耐药死亡。寻找新的卵巢癌治疗方法迫在眉睫。随着分子生物学技术的发展，靶向治疗的研究越来越多，因为肿瘤组织和正常组织之间的差异，通过分子生物技术手段，将药物或者自杀基因靶向导入到肿瘤组织内，而对正常组织无损害。基因的靶向治疗重要的是将基因转入在体内并在特定的组织内表达，其中为重要的部分是特异性启动子的作用。文章就启动子的特性，对卵巢特异性启动子的分类及研究进展作综述。
-
HBV靶向腺相关病毒载体的构建与鉴定
目的：构建和鉴定HBsAg靶向性的重组2型腺相关病毒（ adeno?associated virus， AAV2）载体。方法运用噬菌体展示技术筛选特异性结合HBsAg的多肽，通过重组PCR技术将特异性多肽插入到2型腺相关病毒（AAV2）核衣壳蛋白的587位氨基酸处，构建靶向结合HBsAg的重组AAV2病毒。流式细胞术检测重组病毒感染HepG2?215细胞的特异性。结果筛选得到HBsAg特异性多肽，序列为SSYAPYVWQ?PIA。成功构建了携带靶向 HBsAg 多肽的重组 AAV2，命名为 rAAVssyU6?hrGFP。 rAAVssyU6?hrGFP 对HepG2、 HepG2?215细胞的感染率较AAV2明显升高，对HepG2?215细胞的感染率高， HBsAb封闭实验明显降低rAAVssyU6?hrGFP病毒感染HepG2?215细胞的效率。结论 rAAVssyU6?hrGFP对HepG2?215细胞的感染具有特异性，有望成为介导siRNA分子有效治疗HBV的靶向载体。
-
靶向Survivin的RNA干扰与膀胱癌
膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤,在我国泌尿外科肿瘤中发病率和死亡率均占首位[1],近年来发病率有增加趋势.膀胱癌绝大多数(90%以上)来自移行上皮,多数以非浸润方式生长,复发非常普遍(50%～70%),在保留膀胱手术后多以膀胱内灌注化疗药物来控制,但仍有10%～15%的表浅性膀胱癌终发展成浸润性膀胱癌或者发生转移[2],而晚期膀胱癌患者又缺乏有效的治疗方法.因此,寻找一种对浸润及术后复发有靶向基因治疗的方法一直是基础和临床研究的重要课题.
