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补肾活血方对大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化的影响
目的观察中药补肾活血方对体外培养SD大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化的影响.方法取新生的SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞.应用MTT法,对硝基苯磷酸盐法(PNPP)及茜素红染色方法观察不同浓度补肾活血方对体外培养成骨细胞在24、48、72h不同时段的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化结节形成的影响.结果不同浓度的补肾活血方均可促进成骨细胞增殖率提高,以中、高浓度组的作用较为明显(P＜0.01);不同浓度补肾活血方可使ALP活性增强(P＜0.01);中、高浓度组补肾活血方矿化结节数量,显著多于对照组(P＜0.01).结论补肾活血方具有促进成骨细胞的增殖、分化及矿化的作用.
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兔BMSCs体外培养及诱导为成骨细胞的研究
骨髓间充质干细胞的特性表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能.成骨细胞是骨组织形成过程中的一种重要细胞,在骨缺损的修复过程中起关键作用,特别对构建用于修复骨缺损的组织工程化骨组织来说尤其重要,但成骨分化的调控机制和应用值得进一步研究.
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SARS-CoV在Vero细胞培养中的多形性特征
为揭示SARS相关冠状病毒 (SARS-associated coronavirus,SARS-CoV)的复制特点,并探讨该病毒的致病机制,利用负染电子显微镜 (EM)、超薄切片EM和免疫EM技术研究了SARS-CoV在Vero细胞上的形态学特征.结果显示,成熟病毒颗粒多为圆形或椭圆形,直径80～120nm,包膜上有放射状排列的纤毛样突起,长约20nm,基底窄.此外可见哑铃形、肾形及"钉子样"等多形性成熟病毒颗粒,这些颗粒能与病人恢复期血清和抗S蛋白抗体反应.细胞内病毒颗粒多位于包涵体内,呈显著的多形性,直径为20～400nm,其形状可分为:①圆形、肾形或椭圆形;②管样结构;③不规则形,如三角形、哑铃形等,另外可见一种特殊的分枝样颗粒.颗粒电子密度不一,有实心和空心两种,其中空心颗粒周边的电子密度高.还观察到螺旋形的病毒核衣壳结构.
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嵌合中国河北株包膜蛋白基因的HCV细胞培养模型的传代分析
建立稳定的嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系,进行传代特性分析.本研究经体外转录获得嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)全长RNA,脂质体法转染Huh7.5-CD81细胞,连续传代培养,进行Real Time RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot、再感染试验与感染滴度检测及序列分析.结果表明:嵌合重组HCV RNA转染Huh7.5-CD81细胞后可产生感染性的病毒颗粒(HCVcc);传代过程中,Western blot可检测细胞内HCV蛋白的表达;IFA检测阳性细胞数逐渐增多,41d升至高峰,达80％～90％;RealTime RT-PCR检测传代细胞上清中HCV RNA拷贝数在104～107拷贝/mL;再感染实验嵌合HCVcc高感染滴度为104 ffu/mL.序列分析显示在传代后期嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变,导致6处氨基酸改变.结论嵌合中国河北株1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养体系可以产生具有感染性的嵌合HCV病毒颗粒,传代后感染性增强并且嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变.
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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白基因片段的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(SARS)病毒为冠状病毒科.该病毒主要引起以破坏呼吸道肺上皮细胞为主的全身性疾病,引发免疫抑制和全身感染.同时,SARS病毒感染与全身血管病变有关.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,表达了SARS冠状病毒S1蛋白的C端部分,此区域包含主要中和抗原位点[1].利用原核表达系统快速高效的特点,可以迅速表达重要的新病原活性蛋白,为进一步建立特异性诊断方法、疫苗动物试验、中和抗体诱导、基因工程疫苗的研制提供实验手段和依据.同时也为疫苗研究提供了新的战略思路.
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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒N蛋白基因的表达及其初步应用
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的病原是SARS冠状病毒[1],该病毒引起以呼吸道肺上皮细胞损害为主的全身性疾病,引发免疫抑制而造成全身感染.同时,SARS病毒感染导致全身血管病变,是一种传染性很强的新病原.目前,在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法,细胞培养的抗原面临纯化困难和操作的危险性.我们利用基因重组的方法,在大肠杆菌中表达了SARS冠状病毒N蛋白全长基因,为进一步建立特异性诊断方法、基因工程疫苗的研制提供了备选实验材料.
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棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒在细胞系中持续感染的建立和特性栽
棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)能够在棉铃虫蛹卵巢细胞素SFE-HA-8212中有效复制,引起细胞解体死亡.通过培养HaSNPV感染后残存的细胞,建立了一株持续感染的细胞.该细胞在传代培养的6个月时间内(约25次传代),持续地释放有感染力的病毒粒子,培养液中病毒的效价多在104 TCID50/ml上下,同时有一小部分细胞(1%左右)中形成多角体,释放病毒的细胞占总细胞数的1.0%～3.8%.持续感染细胞的生长特性与原细胞系相比有一定的变化,对HaSNPV感染的敏感性有所降低.另一方面,持续感染细胞所释放的病毒对SFE-HA-8212及棉铃虫幼虫的感染力也有所降低.讨论了持续感染的可能机制.
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细胞培养实验中细胞系鉴定及质量控制重要性探讨
目的 以脑胶质瘤细胞系(U87)为例,探讨对在细胞培养实验中所使用的细胞系进行鉴定和质量控制的重要性.方法 对三株不同来源的U87细胞系进行STR分型检测,并结合显微镜下形态学特征,判断所测细胞系是否为真正的U87细胞系及是否发生交叉污染.结果 通过细胞STR分型结果与ATCC、DSMZ中STR数据库对比,得出U87-1细胞分型与ATCC中U-87 MG Glioblastoma-Astrocytoma Humanl00％匹配;U87-2细胞分型与DSMZ数据库中U-87MG100％匹配;U87-3未得到扩增产物,不能进行分型,原因是该细胞株为非人源细胞.结论 细胞培养实验中所使用细胞系的鉴定对于后续研究具有重要意义,可使用STR分型检测技术在细胞系培养过程中进行质量控制,对其进行准确鉴定,并排查是否存在细胞交叉污染.
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猪骨髓间质干细胞分离培养及表面抗原鉴定
目的 建立猪骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)体外分离培养、纯化的方法,观察其生物学特性,为其作为组织工程学种子细胞提供实验基础.方法 取猪的胸骨骨髓6～8ml,用Ficoll淋巴细胞分离液提取单核细胞,采用贴壁法培养.接种后2h利用倒置显微镜观察细胞的大体形态,并利用流式细胞仪检测细胞抗原表达.结果 原代培养接种3～4h后细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数量明显增多,3～4d后细胞呈纺锤形且形成为单个或数个细胞克隆,7～9d后集落迅速增多,细胞融合,在10～12d细胞铺满全层.流式细胞仪监测到BMMSC表达CD29、CD44、CD105、KDR,不表达HLA-DR、CD11a、CD14、CD31、CD34、CD45.结论 采用密度梯度离心法培养猪的BMMSC生长稳定,增殖能力强,具有间质干细胞的表面抗原特征,该方法可作为培养猪BMMSC的常规方法.
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小口径组织工程血管生物反应器的制造
生物反应器在构建小口径组织工程血管中起着重要的作用.本文设计并造了能够模拟人体小口径动脉脉动流的生物反应器.该反应器的波形发生器输出成年人左心室容积变化信号驱动直线电机作为动力源,通过调节后负荷,从而产生近生理的脉动流.特殊设计的旋转培养室可以对三维的管壁支架进行二次的细胞接种.并且使得旋转接种和脉动培养能够连续进行.与现有的组织工程血管生物反应器相比,在理论和实践上有较大的创新性.
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生物反应器在组织工程中的应用
组织工程学是利用生命科学与工程科学原理,体外制备用于修复受损组织的移植物,以满足器官移植需求.目前制备的工程化组织存在生物活性差和经济成本高的缺陷,限制了其临床应用.生物反应器是制备工程化组织的重要设备,它可以促进营养物质交换和增加机械应力刺激等.通过对培养微环境的精细调控,生物反应器可以促进工程化组织的熟化,降低成本,从而推动工程化组织的实际应用.
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聚合物微载体及其在细胞培养方面的应用
微载体培养系统是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法.介绍了微载体系统培养细胞的优越性,评述了近年来常用的几种制备微载体的天然聚合物材料,较为详尽地总结了微载体特别是大孔微载体的制备方法和微载体的改性方法.目前关于用微载体培养细胞来生产生物医药制品的研究较多,重点评述了天然聚合物材料制备的微载体在组织工程领域的应用前景.
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内皮祖细胞的体外培养
目的 建立一个体外培养脐血来源内皮祖细胞(EPC)的培养体系.方法 脐带血经密度梯度离心获得单个核细胞,按本室已建立的培养体系培养细胞,免疫细胞化学和流式细胞术对培养7 d后的细胞进行CD34、CD133、vWF、CD146及CD144鉴定.结果 接种后前5 d为生长的潜伏期,细胞开始贴壁,无明显扩增.第6天平均每个视野下细胞数目为287±45;第9天细胞数为282±46;第12天开始,细胞进入对数生长期,细胞数为805±67(P＜0.05);第19天细胞继续增殖,细胞数为1 115±182(P＜0.05);第23天时,细胞进入凋亡期,数量明显减少,为265±61(P＜0.05).vWF、CD146、CD144表达阳性.流式细胞术结果表明,梭形样细胞群体中,CD34阳性率为88.98%±5.15%(P＜0.05),CD133阳性率为1.20%±1.44%(P＜0.05).结论 利用本实验室的培养体系成功培养出内皮祖细胞.
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基质细胞衍化因子-1对人内皮祖细胞迁移的影响
目的 探讨基质细胞衍化因子-1对内皮祖细胞迁移的影响.方法 用流式细胞仪、RT-PCR、内皮功能实验鉴定内皮祖细胞,检测其CXCR4受体表达和迁移功能.结果 培养单个核细胞7 d,CD34阳性率为36.3%±23.8%,CD133为19.7%±10.3%,双阳性率为18.6%±10.7%,表达KDR基因,>90%的细胞吸收DiI-ac LDL和FITC-UEA-1.CXCR4表达率为74.8%,对照组、基质细胞衍化因子-1浓度为10、20和50μg/L时,细胞迁移数分别为3.5、7.4、24.9和28.0个.各组浓度的细胞迁移数均显著高于对照组(P<0.01),20μg/L组显著高于10μg/L组、50μg/L组显著高于10μg/L组(P<0.01),50μg/L组显著高于20μg/L组(P<0.05).结论 (1)从外周血途径分离、培养和扩增获得内皮祖细胞,表达CXCR4受体;(2)内皮祖细胞可在基质细胞衍化因子-1的趋化作用下迁移,且与其浓度呈正相关.
关键词： 内皮祖细胞 细胞培养 基质细胞衍化因子-1 CXCR4 -
人胚胎肝细胞的体外培养及表型观察
目的 观察体外培养的人胚胎肝细胞的特性.方法 采用胰酶分步消化法体外分离人胚胎肝细胞,在培养的不同代数,收集培养上清液测定甲胎蛋白、白蛋白及5种特异性酶(ALT、AST、GGT、ALP、LDH)的分泌量,用免疫组化法测定细胞内细胞色素C的表达情况.观察诱导分化剂丁酸钠对该细胞的作用效果.结果 体外分离培养的肝细胞在DMEM培养基中呈单层多边形上皮样生长,常规传代可维持约5个半月(30代),在传代过程中具有分泌白蛋白及5种特异性酶的生理功能.结论 建立的人胚胎肝细胞系,保持了肝细胞的表型及分泌多种特异性酶.
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阿司匹林对化学性缺氧状态下新生大鼠脑神经细胞[Ca~(2+)]i和NGB的影响
目的 探讨阿司匹林(ASA)对化学性缺氧大鼠脑神经细胞的保护作用及细胞外钙离子对ASA神经保护作用的影响.方法 分别在含钙和去钙培养液中加入连二亚硫酸钠(Na_2S_2O_4)诱导化学性缺氧,用ASA预处理体外培养的大鼠脑细胞,激光共聚焦显微镜观察[Ca~(2+)]i和脑红蛋白(NGB)的变化.结果 化学性缺氧使大鼠脑细胞[Ca~(2+)]i和NGB表达增高(P＜0.05,n=5).ASA预处理可明显缓解缺氧组和无钙缺氧组大鼠脑细胞中[Ca~(2+)]i和NGB的增高(P＜0.05,n=5).结论 ASA可能通过减少大鼠脑细胞的钙超载,抑制缺氧诱导的NGB表达增高,发挥神经细胞保护作用.
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小鼠睾丸支持细胞对大脑皮质细胞的体外营养作用
目的 通过观察睾丸支持细胞(SCs)对大脑皮质细胞体外的营养作用,探讨移植的SCs在体内对神经组织营养作用的方式.方法 将原代分离的小鼠大脑皮质细胞单独培养(对照组)或与小鼠SCs共培养(实验组),比较两组中神经元、神经干细胞(NSC)及神经胶质细胞的生长情况.结果 实验组的神经元数及其突起数、神经元特异性烯醇化酶光密度(P＜0.01)和神经胶质细胞数均较对照组高,两组各时期的神经元胞体面积也不相同(P＜0.05),实验组于第3天出现NSC的集落形成.结论 SCs在体外对大脑皮质的神经元、NSC和神经胶质细胞均有较强的营养作用,在中枢神经系统疾病的细胞移植治疗中将具有很大的应用价值.
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阿仑膦酸钠对兔破骨细胞功能的影响
用骨陷窝形成分析法观察阿仑膦酸钠对体外培养破骨细胞功能的影响,探讨可能的作用机制.在建立兔破骨细胞培养方法的基础上,用不同浓度的阿仑膦酸钠分别与骨片或成骨细胞提前作用,然后再将骨片或成骨细胞分别与破骨细胞共同培养.结果发现当阿仑膦酸钠(10-11,10-9,10-7mol/L)与骨片预处理后,破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝数目减少,其抑制率分别为19.5%(P＜0.05)、49.0%(P＜0.01)和74.5%(P＜0.01).用阿仑膦酸钠(10-9,10-7,10-5mol/L)预处理成骨细胞后,仅在高浓度(10-5mol/L)时可见破骨细胞骨吸收陷窝的数目明显减少,其抑制率为62.8%(P＜0.01).结果表明阿仑膦酸钠能直接或通过成骨细胞间接抑制破骨细胞的骨吸收活性.
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GDNF促进大鼠背根神经元的存活和突起生长
探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对正常胚胎大鼠背根神经节(DRGn)的存活及突起生长的作用.本实验采用神经组织原代分离培养的方法建立体外胚胎大鼠背根神经节单细胞培养体系,从细胞形态学及应用MTT法观察1μg/L、10μg/L、50μg/L和l00μg/L GDNF对体外培养的正常感觉神经元生长的影响.结果表明:GDNF能明显促进体外培养的正常大鼠背根神经节感觉神经元的存活及突起生长.提示GDNF对正常大鼠胚胎发育期感觉神经元具有神经营养作用.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 背根神经节 细胞培养 -
体外新生小鼠嗅鞘细胞的生物学特性
目的 研究新生小鼠嗅鞘细胞的生物学特性.方法 自新生小鼠嗅球中分离并纯化嗅鞘细胞,用免疫细胞化学和RT-PER对其进行检测.结果 体外培养的新生小鼠嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其纯度可以达到88.7%以上,污染细胞中有星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞和成纤维细胞.免疫细胞化学结果显示,嗅鞘细胞呈 P75NGFR、NGF、BDNF和CNPase免疫阳性,GFAP和Nestin阴性.RT-PCR结果显示,嗅鞘细胞表达β-NGF、BDNF、NT-3、PDGF-B、bFGF、EGF、TrkA和TrkB的mRNA,而不表达NT-4.结论 本研究对新生小鼠嗅鞘细胞的形态学、免疫细胞化学和分子生物学特性提供了部分实验数据.但不同动物来源、不同的取材时间和培养条件对嗅鞘细胞的影响尚需进一步研究.
