首页 > 文献资料
-
成年大鼠纹状体区神经干细胞的分离培养
目的从成年大鼠纹状体区分离并鉴定神经干细胞. 方法利用无血清培养和单细胞克隆技术在成年大鼠纹状体区分离具有单细胞克隆能力的细胞群,选取单个克隆进行连续传代培养获得大量亚克隆,采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达. 结果从纹状体区分离的细胞群具有连续克隆能力,表达神经上皮干细胞蛋白,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原. 结论分离的细胞具有自我更新能力和多分化潜能,表达神经上皮干细胞蛋白,有很强的增殖能力.是中枢神经系统的干细胞.
-
人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长
目的探讨以人胚胎成纤维细胞为饲养层分离、培养人胚胎生殖细胞的方法和条件.方法分离、培养3～4月胚胎成纤维细胞,取3～15代细胞经丝裂酶素处理后铺板备用;分离6～11周胚胎原始生殖细胞,将其置于人胚胎成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞;用免疫细胞化学方法检测胚胎生殖细胞表面标志SSEA-1和SSEA-4;钙-钴法检测碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达.结果人胚胎成纤维细胞可连续传代25代以上(6月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞.分离的胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过8代.集落未分化标志检测显示SSEA-1、SSEA-4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,Oct-4表达阳性.结论用人胚胎成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞.
-
不同浓度的银杏内酯B 对培养的神经干细胞分化的影响
目的探讨不同浓度的银杏内酯B对神经干细胞分化的影响.方法从新生大鼠海马中分离和培养神经干细胞.将其接种在24孔培养板中,并分成4组:20 mg/L内酯B组、40mg/L内酯B组、60 mg/L内酯B组和对照组.4组神经干细胞被分别加入含不同浓度银杏内酯B的DMEM/F12培养液,在培养7 d和14 d后,用免疫细胞化学染色方法检测其神经丝蛋白(NF)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞特异性蛋白(Oligo)的表达,并计算阳性染色细胞的百分率.结果在同一时间内不同浓度银杏内酯B组分化为NF阳性神经元样细胞的百分率都比对照组高,但不同浓度之间没有显著差异.在同一时间内不同浓度银杏内酯B对少突胶质样细胞的百分率影响不大.而不同浓度银杏内酯B组分化为GFAP阳性星形胶质样细胞的百分率都比对照组高,并随其浓度的增加而百分率增高.结论不同浓度的银杏内酯B可促进神经干细胞向神经元样细胞分化,但与其浓度关系不大;对少突胶质样细胞的百分率影响不大;对星形胶质样细胞的百分率有促进作用,并随浓度的增加而增高.
-
缝隙连接蛋白43在培养的新生大鼠心室肌细胞中的时空表达
目的 讨连接蛋白43(Cx43)在培养的新生大鼠心室肌细胞中的时空表达变化规律.方法 利用免疫细胞化学方法及免疫电镜技术,观测培养2、4、8、10、12、16、20、26、30d大鼠心室肌细胞Cx43蛋白的表达;结果培养第2d心肌细胞开始表达Cx43,表达部位主要在细胞质中,呈点状;第4d细胞质中点状分布减少.主要集中在细胞膜连接处;第10d在细胞连接处增多,呈条、链状分布;以后基本恒定,无明显变化;第30d时Cx43颗粒出现紊乱分布; 绪论 Cx43在培养的新生大鼠心肌细胞中的表达随培养时间延长而出现位置和量的变化,与培养心肌细胞的生长、发育及功能变化一致.
-
胶质细胞源性神经营养因子对培养的背根神经节的影响
目的探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在体外促进正常胚胎大鼠背根神经节(DRGn)的存活及突起生长情况. 方法用原代分离培养法建立体外胚胎大鼠背根神经节单细胞培养体系,通过活体观察、MTT微量比色法、NSE免疫组织化学染色观察不同浓度GDNF对体外培养的正常感觉神经元的影响. 结果 GDNF组培养的DRG神经元存活数量增加,神经元突起的长度比对照组明显增长. 结论 GDNF能明显促进体外培养的正常大鼠胚胎背根神经节感觉神经元的存活及突起生长,表明GDNF对正常大鼠胚胎发育期感觉神经元具有神经营养作用.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 背根神经节 细胞培养 大鼠胚胎 -
施万细胞对培养的神经干细胞存活及其分化的影响
目的探讨施万细胞能否在体外促进神经干细胞的存活和分化.方法分离和克隆新生大鼠海马组织的神经干细胞;同时获取坐骨神经和臂丛神经,从中分离和纯化施万细胞.将施万细胞和神经干细胞进行共培养,借助免疫细胞化学技术检测培养的神经干细胞巢蛋白(nestin)的表达及其分化后神经丝蛋白(NF)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.应用扫描电镜观察神经干细胞的形态变化.结果与施万细胞一起培养的神经干细胞存活数量增加,分化为神经元样细胞的数量也明显增加.这些神经元样细胞的初级突起比对照组的明显增长.施万细胞能使神经干细胞胞体表面不规则的凹凸变得平整.共培养的施万细胞和神经干细胞可以3种方式接触生长:1.胞体与胞体接触;2.胞体与突起接触;3.突起与突起接触.结论施万细胞能促进体外培养的神经干细胞的存活及其分化为神经元样细胞.
-
人牙周膜细胞在左旋聚乳酸/羟基磷灰石生物材料上的生长观察
目的 观察电纺左旋聚乳酸,羟基磷灰石(PLLA/HA)生物材料(简称生物材料)的生物相容性,并以人牙周膜细胞作为种子细胞与生物材料复合培养,探索该生物材料用于人牙周组织再生的可能性.方法 用电纺法制备PLLA/HA纤维生物材料;组织块法分离培养人牙周膜细胞,并用免疫组织化学方法鉴定;MTT法评价生物材料的生物相容性;将人牙周膜细胞与生物材料复合培养,用扫描电镜进行观察;将转染人腺病毒介导的绿色荧光蛋白的人牙周膜细胞与生物材料复合培养,用激光扫描共焦显微镜观察.结果 成功分离了人牙周膜细胞.波形蛋白染色阳性确定该细胞来源于中胚层;MTT法检测人牙周膜细胞在生物材料上的增殖状况与正常培养基本一致;扫描电镜下可见细胞在生物材料上生长旺盛、充分伸展;激光扫描共焦显微镜下可见人牙周膜细胞沿生物材料呈纤丝生长,表现出一定的三维结构.结论 电纺PLLA/HA生物材料具有三维空间网状结构和良好的生物相容性,与人牙周膜细胞复合培养有利于细胞的生长、贴附和增殖,并呈现一定的立体结构,为人牙周组织再生提供了实验依据.
-
人椎间盘髓核细胞突起的形态学特征
目的 探讨成人腰椎间盘髓核细胞突起的形态学特征.方法 取8例成人腰椎间盘髓核组织标本(Thompson Ⅰ～Ⅱ),分别行冰冻切片和电镜切片,同时进行髓核细胞的分离和单层培养,利用光镜、激光扫描共焦显微镜和透射电镜,从组织、细胞和超微结构水平观察细胞突起的形态学特征.结果 所有的髓核细胞均具有明显的突起结构,相邻的细胞突起间可见缝隙连接.在体状态下均呈类圆形的髓核细胞进行离体培养时却呈现梭形和类圆形两种不同的形态,梭形细胞与类圆形细胞的比例约为2.3∶1.梭形细胞的突起顺着细胞体长轴发出,未见二级突起.类圆形细胞的突起从细胞体四周发出,突起呈树枝状,可见多级突起.结论 突起是椎间盘髓核细胞的形态学特征之一,对突起功能的深入研究将有助于加深对椎间盘退变病理机制的认识.
-
应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞
目的 探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征.方法 将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs).将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α一横纹肌肌动蛋白(asarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、a-MHC基因表达,鉴定细胞分化.结果 将5-aza诱导形成的:EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric:actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、αMHC基因.10μmol/L5-aza处理组心肌细胞分化率较高.结论 5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关.
-
人子宫内膜基质细胞和腺体细胞的分离培养及鉴定
目的 人子宫内膜分离培养并得到纯度较高的内膜基质细胞和腺体细胞。 方法 采用二次滤网过滤法进行分离并通过光镜观察和免疫细胞化学染色对其进行鉴别。 结果 基质细胞在接种后0.5h开始贴壁，可见梭形和多角形两种形态的细胞。免疫细胞化学染色显示这两种细胞均具有波形蛋白免疫反应性，反应率可达95%以上，而细胞角蛋白无免疫反应性，提示它们为来源于内膜基质的基质细胞。大部分腺体细胞在接种24h后贴壁，培养后4d左右腺体细胞呈旋涡状排列，单个细胞为多角形，核大而圆。腺细胞呈细胞角蛋白免疫反应性，反应率在90%以上。 结论 采用二次滤网过滤法可成功地分离人子宫内膜基质细胞和腺体细胞。
-
音猬因子的功能受体斑片在培养神经干细胞中的表达
目的观察在培养的神经干细胞内是否有发育调控分子--音猬因子(sonic hedgehog)功能受体--斑片(patched)表达. 方法神经干细胞克隆在体外培养传代后,用patched的特异性引物对培养的神经干细胞进行RT-PCR分析,PCR产物经克隆测序后,用地高辛标记克隆的探针,对神经干细胞进行原位杂交分析. 结果神经干细胞克隆内大量的细胞均可表达sonic hedgehog的功能受体patched,patched阳性细胞间未见明显差别,克隆边缘与中央的patched分布也未见明显差别. 结论 sonic hedgehog信号传导路可能在神经干细胞的增殖与分化过程中起重要作用.
-
睾丸支持细胞促进体外培养神经元生长的研究
目的探讨睾丸支持细胞(SC)对体外培养神经元生长发育的促进作用. 方法将SCs制备成饲养层和SCs条件培养液(SCM)后与神经元共培养,观察培养细胞的存活数和突起数,并应用图像分析仪观察细胞的面积. 结果 SCs饲养层及SCM培养神经元的存活数、突起数和胞体面积明显高于对照组(P<0.01). 结论SCs对体外培养的神经元具有显著的促生长作用.
-
应用二甲基亚砜体外诱导P19细胞分化为心肌细胞
目的观察P19细胞经二甲基亚砜(DMSO)诱导及不同培养方法,培养形成细胞聚集体并向心肌分化的过程.方法将P19细胞接种于Petri塑料培养皿或铺有0.5%软琼脂的培养皿中,DMSO诱导悬浮培养7 d形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至19 d.观察细胞跳动情况,用α-sarcomeric actin、cardiac Troponin T(cTnT)抗体进行免疫组织化学染色,鉴定细胞分化.结果经DMSO诱导7d,将形成的细胞聚集体用生长培养基黏附培养至15 d,在聚集体周围的生长晕中出现自发性节律跳动的细胞团片,α-sarcomeric actin及cTnT染色阳性,至19d,阳性率分别可达26%和15%.结论 DMSO诱导结合聚集体形成培养方法可诱导P19细胞向心肌细胞分化,并出现自发性有节律跳动.
-
三七总皂苷对体外培养的大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用
目的 探讨不同剂量三七总皂苷( PNS)对体外培养的新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法 无血清原代培养新生SD大鼠海马NSCs,利用巢蛋白(Nestin), 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU) 和神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 对培养的NSCs 进行鉴定.将培养的细胞分为对照组、PBS组和PNS组,PNS组包括0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 g/L组,观察各组细胞克隆形成率、细胞增殖曲线和细胞分化比例.将培养的细胞分为对照组和0.4 g/L PNS组,利用流式细胞仪检测PNS对海马神经干细胞分化的影响.结果 海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU 染色阳性.加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈Tuj-1和GFAP阳性.与对照组相比,中低剂量组(0.1、0.2、0.4 g/L)对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的三七总皂苷(0.8 g/L及1.0 g/L)干预组则明显抑制了NSCs的增殖,差异有统计学意义(P < 0. 05).在分化条件下,三七总皂苷0.4 g/L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,差异有统计学意义( P < 0.05).结论三七总皂苷能够调节体外培养的大鼠海马 NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例.
-
胚胎小鼠下丘脑培养状态SRIF神经元的发生--免疫细胞化学研究
目的研究胚胎小鼠下丘脑培养状态下SRIF神经元的发生. 方法采用原代分离培养的方法,将胚胎小鼠下丘脑进行体外分散细胞培养,观察了下丘脑细胞的生长分化过程,并且对培养不同时间的细胞作生长抑素(SRIF)免疫细胞化学染色,阳性神经元记数,各种形态神经元所占的百分比统计. 结果胚胎小鼠下丘脑SRIF阳性神经元在体外生长发育不同时间细胞指数不同:7d时为24±1.52,10d时为34±2.20,12d时为34±3.30,14d时为104±6.32,16d时为68±5.34,20d时为29±1.54,其中在培养14d时,SRIF阳性神经元达到高峰,以后出现下降趋势.而且神经元的形态、单极、双极、多极神经元的数目以及突起呈色深浅在发育过程中也有较大的变化,各种占比例较大神经元出现的时期也不一样,其中,单极在培养10、14、16d时分别占52.3%、60.0%、43.3%.双极在培养10、14、16d时分别占30.7%、20.7%、30.1%.多极神经元在培养7、12、20d时分别占81.5%、90.1%、67.3%. 结论 (1)在培养状态下,下丘脑不同核区的细胞发育速度不同,并且随时间点的变化呈现规律性变化;(2)不同类型的SRIF神经元的发育随着不同的时间点呈现出不同比例很可能反映一些SRIF神经元的功能发生了转化;(3)体外培养状态下SRIF神经元的发育可能反映在体SRIF神经元的情况.
-
大鼠视网膜内髓鞘形成模型的建立与研究
目的研究体外培养的大鼠纹状体神经干细胞在植入同种视网膜后,向少突胶质细胞分化并产生髓鞘的过程,观察髓鞘形成对视网膜结构的可能影响,建立一种中枢神经髓鞘体内发育的新模型.方法将体外传代培养的胚胎纹状体神经干细胞植入新生大鼠的玻璃体腔内,在移植后不同时期观察视网膜内髓鞘的出现部位以及扩展趋势,利用不同染色方法对标本进行检验分析,利用透射电镜进行超微结构观察.结果移植细胞4周后部分视网膜内开始出现成束髓鞘,只分布于神经纤维层.髓鞘束出现的比例、分布面积和形态变化与移植后动物的存活时间相关.电镜观察可见节细胞轴突外包绕有结构正常的中枢神经样髓鞘.较厚的髓鞘束对视网膜节细胞的分布产生一定影响.结论大鼠纹状体神经干细胞可在同种视网膜内向成熟少突胶质细胞分化,视网膜神经纤维层具有促使髓鞘形成的作用;本实验可能为研究少突胶质细胞分化及髓鞘生成机制提供新的在体模型.
-
小鼠胚胎大脑皮质与中脑神经干细胞培养与分化比较的研究
目的比较小鼠胚胎脑皮质与中脑来源的神经干细胞在培养与分化方面的差异,为更好的研究和利用神经干细胞提供实验依据.方法无菌条件下分别分离鼠胚大脑皮质与腹侧中脑,经胰酶消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基,培养扩增;倒置显微镜观察比较生长状况;机械方法传代;10%血清接种分化;免疫荧光细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向,并作比较.结果小鼠胚胎脑皮质与中脑均存在神经干细胞,其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性,并都能分化为神经元和胶质细胞;但皮质部位所含神经干细胞明显多于中脑,也更宜成球;有血清条件下分化,皮质神经干细胞未见分化为酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元;中脑神经干细胞则可少量分化为TH阳性神经元结论同样条件下皮质神经干细胞比中脑神经干细胞更易增殖与培养,两者在有血清条件下分化为TH阳性神经元能力方面有差异.
-
不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞比率的研究
目的 比较不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞的比例.方法 取胎龄8～12 周的人胚胎脑海马,机械分离成单细胞悬液,以2×106 个细胞/ml接种到含h-EGF、h-bFGF和h-LIF的DMEM/F12培养液中.用1%FBS诱导神经干细胞球分化,12 h后行RNA-结合蛋白(musashil)免疫细胞化学鉴定,分别在2、5、7、14和23 d时行β-Ⅲ微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin/Tuj1)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(galc)免疫细胞化学鉴定.结果 诱导分化12 h时细胞球中绝大部分细胞为Musashil阳性细胞,第2 d时有少量的β-ⅢTubulin和GFAP阳性细胞,未见galc阳性细胞;第7 d时β-Ⅲ Tubulin阳性细胞数目多,约为细胞总数的48.2%,以后逐渐下降,而GFAP阳性细胞数目在第2～23 d内呈逐渐增加趋势,到第23 d时达细胞总数的65.3%;随分化时间延长,只能检测到极少量的galc阳性细胞.结论 1%FBS可促使人神经干细胞分化为中枢神经系统的3种主要细胞类型,且其分化为神经元和胶质细胞的比例在不同时间点上有显著差异.
-
不同诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用
目的 观察体外不同诱导方法对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的作用.方法 体外培养、扩增骨髓MSCs,分别采用化学诱导剂(2-巯基乙醇+二甲基亚砜)和生物诱导剂,诱导骨髓MSCs分化为神经细胞.用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学方法对诱导后的细胞进行鉴定和诱导率分析.应用组织学方法显示尼氏体.结果 倒置显微镜下可见,MSCs经两种方法诱导48h后,细胞均向神经细胞分化,胞体呈锥形、多角形,由胞体伸出较长的轴突样和树突样突起,且有分支.免疫组织化学鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达NSE、NF,不表达GFAP.化学诱导剂组NSE阳性细胞率为86.9%,NF阳性细胞率为85.6%;生物诱导剂组NSE阳性细胞率为88.2%,NF阳性细胞率为86.8%,两组间无显著差异(P＞0.05).硫堇-伊红染色显示胞体内有大量的尼氏体.结论 体外两种诱导方法均可诱导大鼠骨髓MSCs分化为神经细胞.
-
成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养与免疫学特点
目的 探讨成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养方法及嗅鞘细胞(OECs)的免疫学特点. 方法 通过手术取成人嗅区黏膜7例,将其消化为单个细胞后采用差速贴壁法除去成纤维细胞.倒置显微镜下行形态学观察,并利用p75、S100、GFAP抗体对嗅鞘细胞进行免疫荧光化学染色,共焦显微镜下进行各种抗体阳性率的统计.结果 共焦显微镜下可见嗅黏膜细胞中S100和p75阳性细胞多见,GFAP阳性细胞在嗅黏膜细胞中较少见.一般在同一细胞上可见S100和p75共同表达,而GFAP与S100、p75未见有共同表达现象;p75阳性细胞胞体大小和形态也大不相同.经统计S100和p75阳性细胞的平均百分率为(35.0±8.3)%. 结论成功进行了成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养.
