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酵母三杂交技术的应用策略及在病毒研究中的应用
从酵母双杂交系统衍生出来的酵母三杂交系统是一种主要用于研究细胞内RNA-蛋白质相互作用强大的技术方法,也为病毒相关研究,尤其为研究病毒生活史中病毒RNA与病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用提供了新的工具.本文重点介绍了此种形式的酵母三杂交系统的原理、缺陷、应用和应用策略.另外,本文还介绍了同时发展起来的另外两种形式的酵母三杂交系统,即分别用于研究小分子配体-受体相互作用、复杂蛋白质相互作用的酵母三杂交系统.
关键词： 酵母三杂交 RNA-蛋白质相互作用 配体-受体相互作用 蛋白质相互作用 -
膀胱尿路上皮癌组织lincRNA差异表达及机制探讨
目的 筛选膀胱尿路上皮癌与癌旁组织中差异表达长链基因间非编码RNA(long intergenic noncoding RNA,lincRNA),并探讨其可能作用机制.方法 收集2011-01-04-2011-02-18中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科4例膀胱尿路上皮癌与癌旁组织标本并应用Trizol提取总RNA,应用基因芯片筛选差异表达的lincRNAs及mRNAs,应用生物信息学分析差异表达lincRNAs和mRNAs特征,应用EZH2抗体和SUZ12抗体进行RNA免疫沉淀筛选与多梳抑制复合物2 (PRC2)相互作用的lincRNAs.结果 基因芯片筛选发现,共376个lincRNAs及1 284个mRNAs在膀胱尿路上皮癌组织与癌旁组织中存在表达差异(差异倍数≥2.0倍,P＜0.05).lincRNAs表达异常在第1、2、7号染色体常见,mRNAs差异表达基因的信号通路分析显示,参与细胞间黏附、钙离子信号通路、MAPK信号通路和细胞因子间受体相互作用的基因改变为明显.与非免疫血清IgG组相比,应用EZH2抗体和SUZ12抗体进行的RNA免疫沉淀提示,HOTAIR分别富集(11.2±1.7)和(9.6±1.1)倍,BX640973分别富集(36.3±2.1)和(14.7±0.8)倍,NR_024344分别富集(30.2±3.5)和(7.7±1.2)倍,LINC312分别富集(5.1±0.4)和(5.7±0.5)倍,NR_036444分别富集(29.5±1.8)和(11.2±0.6)倍,MALAT1分别富集(12.9±1.6)和(25.1±1.5)倍,MEG3分别富集(13.2±0.6)和(4.0±1.3)倍,差异均有统计学意义,P值均＜0.05.结论 膀胱癌中大量lincRNAs和mRNAs表达发生改变,部分lincRNAs通过与PRC2复合物相互作用发挥功能.
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靶向蛋白质-RNA相互作用的HIV抑制剂研究进展
蛋白质-RNA相互作用是人免疫缺陷病毒(HIV)抑制剂研究的重要靶点,抑制RNA与蛋白质结合是获得具有抗耐药性HIV药物的有效途径.近年来,大量药物的筛选获得了许多蛋白质-RNA相互作用的抑制剂,本文总结了近年来以蛋白质-RNA相互作用为靶点的HIV抑制剂的研究进展.
关键词： 人免疫缺陷病毒(HIV-1) 艾滋病 RNA-蛋白质相互作用 药物设计 抑制剂 -
FXR1P相互作用RNA的研究
目的:本研究利用酵母三杂交系统从人脑海马回cDNA文库中筛选FXR1P的靶RNA,以进一步阐明FXR1基因的功能.方法:将表达FXR1P全长的质粒pYESTrp3/FXR1转化酵母菌株L40ura3/pHybLex/Zeo-MS2,检测毒性和自激活性;应用酵母三杂交技术从人脑海马回pRH3'-cDNA文库中筛选FXR1P的相互作用RNA;分离初步筛选的结果,再次转化含有诱饵质粒的融合菌株L40 ura3/pHybLex/Zeo-MS2/pYESTrp3/FXR1,重新验证阳性结果;后对阳性结果的外源插入片段进行测序和生物信息学分析.结果:酵母三杂交的筛选得到了3个阳性结果,经过测序和同源性分析,其中一个阳性结果中的插入片段为K-ALPHA-1 mRNA的部分序列.结论:K-ALPHA-1 mRNA可能是一种新的FXR1P的靶RNA.
关键词： 酵母三杂交 FXR1P K-ALPHA-1 脆性X综合征 RNA-蛋白质相互作用 -
酵母三杂交系统:一种在真核细胞水平研究RNA-蛋白质相互作用的有效方法
RNA-蛋白质之间的相互作用是真核细胞RNA在细胞内执行其功能的基础,这种相互作用在基因表达的多个水平上均发挥着重要的调控作用.要研究RNA对基因表达的调控就必须对RNA-蛋白质之间相互作用的方式进行研究.本文介绍的酵母三杂交系统(yeast three-hybrid system)是一种近年来在酵母双杂交系统的基础上发展而来的,可用于鉴定先前未知的,在自然界中存在且具有生物学意义的RNA-蛋白质相互作用的实验方法.该方法提供了一个在真核细胞内研究RNA-蛋白质相互作用的技术平台.它可以根据酵母细胞所表现出的简单表型及易于辨别的酶反应,对体内复杂环境中发生的RNA-蛋白质的相互作用进行遗传学分析.
关键词： 酵母三杂交系统 RNA-蛋白质相互作用 -
人RPP蛋白与HCV RNA体外相互作用的测定
目的检测人RPP蛋白与HCV RNA体外的相互作用.方法将人RPP各基因分别克隆至pET28a载体,在大肠杆菌中(BL21)表达的目标蛋白经蛋白纯化仪纯化获得人RPP蛋白;通过体外转录制备32P标记的HCV RNA片段作为探针,利用紫外交联试验研究各种人RPP 蛋白与HCV RNA的体外相互作用.结果 成功表达纯化了8种人RPP蛋白,紫外交联试验结果显示:Rpp20、Rpp21、Rpp29和Rpp304种蛋白可分别与HCV RNA片段结合,Rpp21和Rpp29结合力较强,Rpp20和Rpp30结合力则相对较弱,而其余几种RPP蛋白(包括Rpp14、Rpp25、Rpp40和Pop5)不能与HCV RNA发生结合.结论 人RPP蛋白可与HCV RNA片段在体外直接结合,推测这些RPP蛋白在人RNase P切割HCV RNA的过程中起重要作用.
关键词： 丙型肝炎病毒 人RPP蛋白 RNA-蛋白质相互作用 体外
