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体外人巨细胞病毒感染细胞细胞周期素表达改变与细胞病变的关系
目的探讨人巨细胞病毒( human cytomegalovirus, HCMV)感染的人胚肺成纤维上皮细胞( human embryo lung fibroblast, HEL)细胞周期素 E (cyclin E)、 D (cyclin D)、 A (cyclin A)、 B (cyclin B)表达的改变与细胞病变的关系.方法建立体外 HCMV感染细胞膜型,观察感染细胞感染 12、 48h后细胞病变( cytopathologic effects, CPE);并在相同时间点收获细胞,用乙醇固定 HCMV感染的宿主细胞后用 PI染色,经流式细胞术( FACSVantage)根据细胞 DNA倍性分选出 G1、 S、 G2/M期细胞,然后分别取等量细胞裂解, 用 Western blot分析上面各不同时相细胞中 cyclins的表达.结果 ①培养 12h,仅病毒感染组在电镜可观察到细胞肿胀,其余各组未见明显病变;②培养 48h,与 HCMV169感染组相比,药物干预 HCMV169感染 HEL两组细胞中,光镜及电镜 CPE程度较轻,正常组细胞无 CPE;③乙醇固定细胞经流式细胞术分选,感染 12、 48h细胞均以 G1为主,少见 S期细胞、未见 G2期和 M期的细胞,与正常对照组比较有显著差异( P< 0.05);根据细胞 DNA倍性分选出的各期细胞裂解行 Western blot检测,正常细胞未检测到 cyclins,感染细胞中 cyclin E、 cyclin D有明显表达,未见 cyclin A、 cyclin B的表达.④ Western blot对分选后的感染细胞中 cyclin E、 cyclin D表达的检测与流式细胞术分析的结果一致.结论体外 HCMV感染细胞细胞周期进程受阻与细胞病变关系密切,细胞周期进程异常可能是导致细胞病变的病理学基础.
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硫酸铍诱导人胚肺成纤维细胞凋亡机制研究
目的：观察硫酸铍对人胚肺成纤维细胞（ MRC-5细胞）凋亡的影响。方法取离体培养MRC-5细胞，随机分为对照组，硫酸铍低、中、高剂量染毒组，拮抗剂组和激活剂组。前4组硫酸铍染毒终浓度分别为0、1、10、100μmol／L；拮抗剂组先后分别予终浓度均为10μmol／L的硫酸铍和2-氨基乙酯二苯基硼酸联合处理；激活剂组先后分别予终浓度均为10μmol／L的硫酸铍和肌醇三磷酸（ IP3）联合处理。各组染毒后分别于培养24和48 h时间点收获细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，激光共聚焦法检测细胞内钙离子（ Ca2＋）浓度，实时荧光定量聚合酶链式反应法检测三磷酸肌醇受体Ⅲ型（IP3RⅢ）和B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）的mRNA相对表达水平，酶联免疫吸附法测定IP3 RⅢ和IP3蛋白表达水平。结果在24和48 h时间点的细胞凋亡率，硫酸铍3个剂量组均低于同时间点对照组（P＜0.05），拮抗剂组分别低于同时间点对照组和硫酸铍中剂量组（P＜0.05）；激活剂组48 h时间点细胞凋亡率低于同时间点的对照组（P＜0.05），高于同时间点硫酸铍中剂量组（P＜0.05）。24 h时间点细胞内Ca2＋浓度，在硫酸铍低剂量组低于对照组（P＜0.05），硫酸铍高剂量组高于对照组（P＜0.05）；48 h时间点硫酸铍中和高剂量组细胞内Ca2＋浓度均低于对照组（P＜0.05）；分别与24、48 h时间点对照组和硫酸铍中剂量组比较，拮抗剂组细胞内Ca2＋浓度均下降（P＜0.05），激活剂组细胞Ca2＋浓度均升高（P＜0.05）。24和48 h时间点BCL-2 mRNA表达水平在硫酸铍3个剂量组、拮抗剂和激活剂组均高于同时间点对照组（ P＜0.05）。细胞IP3 RⅢmRNA表达水平在硫酸铍3个剂量组、拮抗剂和激活剂组均高于对照组（ P＜0.05）。24 h时间点IP3 RⅢ蛋白表达水平在硫酸铍中剂量组、拮抗剂组和激活剂组均低于对照组（P＜0.05）；48 h时间点IP3RⅢ蛋白表达水平，在硫酸铍高剂量组低于对照组（ P＜0.05），拮抗剂和激活剂组均高于硫酸铍中剂量组（ P＜0.05）。细胞IP3蛋白表达水平在硫酸铍低、中剂量组以及激活剂组均高于对照组（ P＜0.05），激活剂组高于硫酸铍中剂量组（ P＜0.05）。结论硫酸铍可能通过调节IP3 R／Ca2＋通路，改变细胞内Ca2＋浓度，抑制MRC-5细胞凋亡；IP3可以改善硫酸铍引起的MRC-5细胞内Ca2＋下降。
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胸腺细胞分化抗原-1 DNA甲基化在硫酸铍致人胚肺成纤维细胞纤维化中作用研究
目的 通过观察硫酸铍刺激人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)所致胸腺细胞分化抗原-1(Thy-1)DNA甲基化改变情况,探讨Thy-1在硫酸铍致肺纤维化中的作用.方法 建立离体MRC-5细胞培养实验模型,以终浓度分别为1.0、10.0和100.0μmol/L的硫酸铍染毒(设为低、中、高剂量组),对照组不作染毒处理;另设甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(AZC)干预组(予终浓度为10.0μmol/L硫酸铍和10.0μmol/L AZC处理)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)干预组(予终浓度为10.0μmol/L硫酸铍和0.5μmol/L TSA处理).分别在染毒24、48和72 h后收集细胞,采用实时定量式聚合酶链式反应检测胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Thy-1的mRNA相对表达水平,巢式降落式甲基化特异性聚合酶链式反应检测Thy-1 DNA甲基化水平.结果在24 h时间点,MRC-5细胞中胶原蛋白ⅢmRNA相对表达水平呈随染毒剂量增加而增加的趋势(P<0.05);在48和72 h时间点,MRC-5细胞中胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和α-SMA的mRNA相对表达水平均呈随染毒剂量增加而增加的趋势(P<0.05);3个剂量组MRC-5细胞上述3个指标均呈随着染毒时间的增加而增加趋势(P<0.05).3个剂量组MRC-5细胞Thy-1 mRNA相对表达水平均低于对照组(P<0.05),高剂量组MRC-5细胞Thy-1 mRNA相对表达水平低于低剂量组(P<0.05).中、高剂量组Thy-1 DNA甲基化水平均高于对照组(P<0.05),3个剂量组Thy-1 DNA甲基化水平呈随染毒剂量增加而增加趋势(P<0.05).2个干预组MRC-5细胞Thy-1 DNA甲基化水平均高于对照组(P<0.05),但与中剂量组差异均无统计学意义(P>0.05).结论 硫酸铍刺激可导致MRC-5细胞纤维化的发生;该过程中Thy-1 DNA甲基化程度升高,Thy-1 mRNA表达水平降低,可能是硫酸铍致肺纤维化的重要机制之一.
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槲皮素对人胚肺成纤维细胞分化过程中PI3 K／Akt 信号通路影响
目的：探讨槲皮素对人胚肺成纤维细胞（ HELF）分化过程中磷脂酰肌醇3-激酶（ PI3K）信号通路的影响。方法支气管肺泡灌洗法收集矽肺患者肺泡巨噬细胞（AM），离体用含有二氧化硅（SiO2）粉尘（质量浓度为50 mg／L）的达尔伯克氏改良伊格尔（ DMEM）培养基和不含SiO2的DMEM培养基分别培养18 h，收集AM上清液，在含SiO2的上清液中分别加入终浓度为10、20、40μmol／L的槲皮素。用组织贴块法获取培养HELF，分为空白对照组、AM组、（ SiO2＋AM）组、槲皮素低浓度组、槲皮素中浓度组和槲皮素高浓度组。蛋白印迹法检测HELF中磷酸化的蛋白激酶B（ p-Akt）的表达，免疫细胞化学法检测HELF中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。结果除槲皮素高浓度组外，其余各处理组p-Akt表达水平分别高于空白对照组（ P＜0.05）。（ SiO2＋AM）组p-Akt表达水平高于AM组（P＜0.05）；3个浓度的槲皮素组p-Akt表达水平分别低于AM组和（SiO2＋AM）组（P＜0.05）；槲皮素高浓度组p-Akt表达水平分别低于槲皮素中、低浓度组（P＜0.05）。除槲皮素高浓度组外，其余各处理组α-SMA表达水平均高于空白对照组（P＜0.05）；（SiO2＋AM）组α-SMA表达水平高于AM组（P＜0.05）；除槲皮素低浓度组外，槲皮素中、高浓度组α-SMA表达水平分别低于AM组（ P＜0.05）。3个浓度的槲皮素组α-SMA表达水平分别低于（SiO2＋AM）组（P＜0.05）。槲皮素高浓度组α-SMA表达水平分别低于槲皮素中、低浓度组（P＜0.05）。结论槲皮素可以抑制HELF分化过程中PI3K／Akt信号通路，从而下调α-SMA的表达。
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三磷酸肌醇受体Ⅲ型DNA甲基化对硫酸铍致人胚肺成纤维细胞损伤研究
目的 探讨三磷酸肌醇受体Ⅲ型(IP3RⅢ)DNA甲基化对硫酸铍(BeSO4)致人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)损伤的影响.方法 建立离体细胞培养实验模型,以终浓度分别为1.0、10.0、100.0 μmol/L的BeSO4染毒MRC-5细胞24h(没为低、中、高剂量染毒组),对照组不使用BeSO4染毒.采用巢式降落式甲基化特异性聚合酶链式反应(PCR)法检测IP3RⅢDNA甲基化的变化,实时定量PCR检测IP3RⅢmRNA的表达,激光共聚焦显微镜检测细胞钙离子浓度([Ca2+]i).结果 高剂量组IP3RⅢDNA甲基化值分别低于对照组、低剂量组和中剂量组[(0.26±0.07)vs(0.48 ±o.02)、(0.44±0.04)、(0.37±0.03),P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05];低、中、高剂量组IP3RⅢ mRNA表达量均高于对照组[(0.35±0.08)、(0.31 ±0.05)、(0.71±0.09)vs(0.03±0.01),P＜0.01],高剂量组IP3RⅢmRNA表达量分别高于低、中剂量组[(0.71±0.09)vs(0.35±0.08)、(0.31±0.05),P＜0.01];高剂量组细胞内[Ca2+]i平均荧光强度高于对照组[(6 171.66 ±601.72)vs(3 618.33±559.26),P＜0.05].结论 IBRⅢDNA低甲基化致细胞内IP3RⅢmRNA表达增加,[Ca2+]i增加,可能是BeSO4致MRC-5细胞损伤的重要机制之一.
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离体染尘模型中人胚肺成纤维细胞血红素氧合酶-1及热休克蛋白27表达的时间-效应观察
目的 观察染尘巨噬细胞(AM)上清液对人胚肺成纤维细胞(HELF)血红素氧合酶-1(HO-1)及热休克蛋白27(HSP27)诱导表达的时间-效应关系.方法 经二氧化硅(SiO2)粉尘处理的AM上清液刺激HELF组成离体染尘模型,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测0、2、8、12、16、24 h培养时段的HO-1、HSP27 mRNA表达.同时以二氧化钛(TiO2)为对照.结果 HO-1、HSP27 mRNA相对表达丰度有随时间变化的趋势,且时间因素的作用随着SiO2、TiO2组的不同而有所区别(P<0.05).结论 染尘AM上清液对HELF的HO-1、HSP27表达的诱导具有时间-效应关系,且2种应激蛋白的表达时相不同,两者可能交错对细胞起到保护作用.
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染尘肺泡巨噬细胞上清液致人胚肺成纤维细胞蛋白谱改变
蛋白:热休克蛋白(HSP27)、Per-oxiredoxin Ⅱ亚型b、钙网蛋白-3和钙网蛋白-5类似物等.结论 应用蛋白质组学方法有助于筛选到经不同处理细胞间的蛋白表达差异,为进一步研究矽肺机制提供分子基础.
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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1抑制剂对氢醌致人胚肺成纤维细胞凋亡的影响
目的 探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)特异性抑制剂N-(6-氧-5,6-二氢菲啶-2-羟基)-N,N.二甲基乙酰胺-盐酸(PJ34)对氢醌(HQ)所致人胚肺成纤维细胞(HLF 细胞)凋亡的影响及其作用机制.方法 将离体传代培养的HLF细胞分为阴性对照组、阳性对照组(HQ组)、3个PJ34组和3个PJ34+HQ组.按PJ34不同浓度(0.5、1.0、2.0 μmoLL)分为PJ34的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,作用4 h后检测结果;按PJ34的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组浓度及作用4 h后再分别加入HQ(80μmol/L)分为PJ34+HQ的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,作用24 h检测结果;HQ组仅用HQ 24 h处理.采用PARP-1单克隆抗体荧光标记,流式细胞术检测HLF细胞中PARP-1蛋白表达、细胞凋亡和细胞复制后期(G2)细胞数情况,噻唑蓝(MTT)比色法测定HLF细胞相对存活率.结果 各组给予不同剂量的PJ34 4 h后,HLF细胞的存活(增殖)明显受抑制(P
关键词： 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 PJ34 氢醌 凋亡 人胚肺成纤维细胞 -
染尘巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞应激蛋白诱导表达
目的 观察染尘巨噬细胞上清液对人胚肺成纤维细胞(HELF)血红素氧合酶-1(HO-1)、金属硫蛋白(MT)表达的影响.方法 采用大鼠巨噬细胞(AM)和HELF组成体外模型,采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测二氧化硅粉尘处理AM 24 h的培养上清液刺激HELF细胞的MT1A、M12A和HO-1 mRNA表达情况.同时用二氧化钛作为阴性对照,以不用粉尘处理的AM培养上清液作为正常对照.结果 HO-1能被染尘AM诱导表达且呈良好的剂量-效应关系.MT1A、MT2A也能被诱导表达,但没观察到明显的剂量-效应关系.结论 HO-1可能参与了矽尘致细胞氧化应激过程,起到一定的抗氧化保护作用.
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天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究
目的:探讨天然脑活素对人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)增殖能力和复制性衰老的影响及其机理.方法:光镜下观察MRC-5细胞衰老表型,常规计数细胞代龄、传代速度,MTT法检测细胞增殖活度,X-Gal染色法观察细胞衰老情况,计数衰老细胞百分率.结果:天然脑活素可维持细胞的非衰老表型,增加MRC-5细胞代龄,天然脑活素孵育MRC-5细胞的细胞增殖能力较空白老龄对照组明显升高(P<0.05),细胞的增殖速度显著加快.另外,天然脑活素连续培养的细胞在老龄阶段衰老细胞数显著低于老龄对照细胞(P<0.01).结论:天然脑活素可升高MRC-5细胞增殖能力,有效延缓细胞的复制性衰老.
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沙利度胺对TGF-β1诱导HELF细胞CTGF基因启动子结合蛋白变化的干预作用
目的:探讨沙利度胺(thalidomide,THD)和转化生长因子β1(transformation growth factor-β1,TGF-β1)对人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts,HELF)中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因启动子的作用及其分子机制.方法:利用CTGF 基因启动子驱动的萤光素酶报告基因系统观察TGF-β1 和THD 对HELF 细胞CTGF 基因启动子活性的影响;同时以带有生物素标记的CTGF 基因启动子序列作为探针,采用DNA pull-down 技术分析TGF-β1 和THD 对CTGF 基因启动子结合蛋白的影响.结果:TGF-β1 能显著增强HELF 细胞中报告基因的活性(P <0.01),而THD 以剂量依赖方式显著抑制TGF-β1 上调报告基因活性的效应(P <0.01).同时,TGF-β1 引起的CTGF 基因启动子结合蛋白变化也能被THD 所抑制(P <0.05).结论:CTGF 基因启动子结合蛋白调节可能参与TGF-β1 对HELF 细胞中CTGF 基因启动子的激活过程,而THD 能有效拮抗此过程.
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中药"金叶败毒制剂"对人巨细胞病毒感染细胞病变及细胞周期蛋白表达影响的研究
目的研究中药金叶败毒制剂对人巨细胞病毒(HCMV)感染细胞细胞病变及细胞周期蛋白(Cyclins)表达的影响.方法中药金叶败毒制剂、西药更昔洛韦(药物对照组)与HCMV AD169毒株在体外感染的人胚肺成纤维上皮细胞(humanembryo lung fibrobla st,HEL)共同培养,于12小时及48小时分别用光镜、电镜观察致细胞病变(cytopathologiceffect s,CPE)及其超微结构的改变;用Western Blot检测金叶败毒制剂、更昔洛韦干预HCMV169感染组、HCMV1 69感染细胞、正常培养细胞中Cyclin D、E、A、B1的表达.结果 (1)培养12小时,仅病毒感染组在电镜下可观察到细胞肿胀,其余各组未见明显病变;(2)培养48小时,与HCMV169感染组相比,药物干预HCMV169感染HEL两组细胞中,光镜及电镜CPE程度较轻,正常组细胞无CPE;(3)细胞培养12及48小时,病毒组CyclinE、CyclinD的表达为强,而中药及西药组次之,正常组未见表达,(P均＜0.05),但各组CyclinA、CyclinB均未见明显表达.结论在HEL细胞受HCMV1 69感染导致细胞病变过程中,Cyclins发生了导致细胞周期进程的改变,而中药金叶败毒制剂、西药更昔洛韦能改善HCMV169细胞感染细胞周期的进程,起到延缓CPE的作用.
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丹参注射液对人胚肺成纤维细胞增殖、凋亡及羟脯氨酸表达的影响
目的：探讨丹参注射液对人胚肺成纤维细胞增殖、凋亡及羟脯氨酸表达的影响。方法：转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人胚肺成纤维细胞增殖；四甲基偶氮唑蓝法检测丹参注射液对人胚肺成纤维细胞数的影响；免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原表达；流式细胞仪检测细胞凋亡；比色法观察羟脯氨酸表达。结果：（1）TGF-β1（0、2．5、5、10、20、40μg／L）可剂量依赖性地上调人胚肺成纤维细胞的细胞数。丹参注射液可剂量依赖性下调人胚肺成纤维细胞光密度值。（2）TGF-β1（10μg／L）干预人胚肺成纤维细胞24、48 h时，增殖细胞核抗原表达明显上调，与同时间点对照组相比差异有统计学意义（P ＜0．01）。但丹参注射液预处理后，未发现增殖细胞核抗原表达下调。（3）流式细胞仪检测结果显示，丹参注射液预处理后，与TGF-β1组相比，细胞凋亡率增加（P ＜0．05）。（4）丹参注射液可下调人胚肺成纤维细胞羟脯氨酸表达，与TGF-β1组相比差异有统计学意义（P ＜0．01）。结论：丹参注射液可靶向人胚肺成纤维细胞，通过促进其凋亡、下调羟脯氨酸表达影响气道重塑。
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羟基喜树碱对人胚肺成纤维细胞增殖与凋亡的影响
目的:探讨羟基喜树碱(HCPT)对体外培养的人胚肺成纤维细胞(HFL1)增殖与凋亡的影响.方法:常规培养HFLl细胞,以未加HCPT的HFL1为对照组,以不同浓度梯度(0.008-32 mg/L)HCPT处理的HFL1作为实验组,采用MTT法检测HCPT干预24、48、72h后HFL1的增殖情况:光学显微镜观察干预后细胞的形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;透射电镜下观察细胞凋亡的改变.结果:HCPT对HFL1有明显的抑制作用,在一定程度上呈现剂量-时间依赖性:HCPT处理组HFL]凋亡率较阴性对照组显著升高(F=399.51,P<0.01),并呈药物浓度依赖性.HCPT 0.5 mg/L作用HFL1 48h,透射电镜下可见细胞缩小,核仁消失,染色质浓聚的凋亡状态.结论:HCPT在体外通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来抑制HFL1的生长.
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人巨细胞病毒对细胞周期调控靶点-p53的影响
目的了解HCMV对细胞周期调控靶点p53的影响. 方法建立体外HCMV感染HEL模型,用倒置显微镜观察不同时间下各组HEL的病变效应和用S-P免组化法检测p53蛋白的表达并以FQ-PCR法检测HEL细胞内HCMV DNA拷贝数. 结果(1)HCMV感染使HEL细胞发生病变,细胞内HCMV DNA拷贝数随时间的延长逐渐增加.(2)S-P免疫组化结果提示HCMV感染使HEL细胞p53蛋白的水平升高. 结论HCMV的感染改变了细胞内p53的水平,可能影响其在细胞周期中的正常功能,营造可能有利于病毒复制的环境.
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转化生长因子β型受体Ⅰ基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人胚成纤维细胞中的表达
目的:构建转化生长因子β型受体Ⅰ (transforming growth factor beta receptor Ⅰ,TGFβRⅠ)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体并在人胚肺成纤维细胞株MRC-5上鉴定其沉默效应.方法:构建4种针对人TGFβR Ⅰ基因不同干扰靶点的慢病毒干扰载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,将筛选出的4种有效重组慢病毒干扰载体和其它辅助质粒一起共转染293T细胞并测定病毒滴度.后将4种重组的慢病毒干扰载体分别感染MRC-5细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测它们对靶基因的沉默效率.结果:经双酶切鉴定和DNA测序,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体且插入的序列正确.4种重组慢病毒干扰载体经293T细胞成功包装后,其病毒滴度分别为:siRNA-1 6.37×107 TU/ml、siRNA-2 1.65×108 TU/ml、siRNA-3 4.50×108 TU/ml、siRNA-4 2.31×108 TU/ml,阴性对照组载体包装后的病毒滴度为:1.79×109 TU/ml.4种重组慢病毒干扰载体感染MRC-5细胞的效率均为93％左右.与正常对照组和阴性对照组比较,在感染4种重组慢病毒干扰载体(siRNA-1～4)后,MRC-5细胞内TGFβR Ⅰ mRNA表达水平均明显下降(P=0.000),其中TGFβRⅠ-siRNA-2下降明显,沉默效率好.Western blot结果与qRT-PCR结果一致,4种重组慢病毒干扰载体均能使MRC-5细胞内TGFβR Ⅰ蛋白表达明显下降(=0.000),且TGFβR Ⅰ-siRNA-2干扰效率大.结论:筛选并构建了能有效沉默TGFβR Ⅰ基因的佳RNAi重组慢病毒载体——TGFβR-siRNA-2,从而为后续研究奠定基础.
关键词： RNA干扰 慢病毒载体 转化生长因子βⅠ型受体 人胚肺成纤维细胞 -
当归多糖及小分子提取物对TGF-β1诱导的HELF表达α-SMA、CTGF的影响
目的:观察当归多糖及小分子提取物对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞HELF的增殖及α-SMA、CTGF影响的作用.方法:建立肺纤维化细胞模型,分为空白组、模型组、12.5 μg/ml当归多糖组、25 μg/ml当归多糖组、50μg/ml当归多糖组、25μg/ml当归小分子提取物组、50 μg/ml当归小分子提取物组、100 μg/ml当归小分子提取物组.结合形态观察,检测细胞增殖、羟脯氨酸、MMP-9、TIMP-1含量及α-SMA、CTGF蛋白表达的变化.结果:与空白组比较,各组细胞吸光度值、羟脯氨酸、MMP-9、TIMP-1含量、CTGF、α-SMA蛋白表达均明显增高.与模型组比较,25 μg/ml当归多糖组、50μg/ml当归小分子提取物组细胞吸光度值、羟脯氨酸含量、CTGF、α-SMA蛋白表达均降低,50 μg/ml当归小分子提取物组MMP-9含量下降,25 μg/ml当归多糖组、50 μg/ml当归小分子提取物组TIMP-1含量均增高.形态学观察,模型组细胞数量增多,体积增大,生长旺盛.25 μg/ml当归多糖组、50 μg/ml当归小分子提取物组细胞数量较少,体积较小.结论:当归多糖及小分子提取物能抑制TGF-β1诱导的HELF增殖,减少羟脯氨酸的合成,其作用可能与下调α-SMA、CTGF表达,调节维持MMP-9/TIMP-1之间的平衡有关.
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HELF中IL-33/ST2L-TRAF-6信号通路的激活对其增殖、活化及胶原合成的影响
目的 观察rhIL-33对人胚肺成纤维细胞增殖及其间充质细胞标记物的影响,探讨IL-33/ST2L-TRAF信号通路在肺纤维化形成过程中的作用.方法 培养HELF细胞,PCR检测IL-33受体ST2L mRNA;不同浓度梯度的rhIL-33刺激细胞,MTT法检测不同时间点(24、48、72 h)IL-33对HF细胞增殖的影响;Real-time PCR方法检测IL-33刺激HELF后不同时间点(0、6、12、24、48、72 h)细胞标志性基因α-SMA mRNA、Vimentin mRNA、collagn Ⅰ mRNA及TRAF-6 mRNA的变化;Western blot法检测细胞标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)及关键性信号分子TRAF-6与下游信号分子ERK1/2、JNK、NF-kappaB等的改变.结果 IL-33能促进HELF的增殖,10 ng/ml的IL-33促增殖作用强,且72 h为明显;随着IL-33刺激细胞时间的逐渐延长,在0～72 h内α-SMA、Vimentin、collagen Ⅰ在基因与蛋白水平均先上调后下调,信号分子TRAF-6、ERK1/2、JNK、NF-kappaB(P65)等亦呈现先上调后下调的趋势.结论 IL-33能促进HELF细胞增殖、活化及合成胶原,IL-33/ST2L-TRAF-6通路在此过程中起了关键作用,尤其是在病变早期炎症过程中作用为明显.
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一清片的体外抗病毒作用
目的:一清片是由大黄、黄芩、黄连等味中药组方,采用现代制剂工艺进行提取得浸膏制粒压片而成,具有清热燥湿、泻火解毒、化瘀止血之功能,上呼吸道感染是其主治之一, 由于呼吸道多见病毒感染,为此,观察一清片的抗病毒作用.方法:不同浓度的药物与100TCID50的腺病毒3、7型和合胞病毒等容量混合,室温作用1小时,取此混合液0.2ml接种于人胚肺成纤维细胞突变株细胞管中吸附45分钟后,加足2%小牛血清Eagles维持液,37℃温孵培养24小时,移33～35℃旋转培养器培养,逐日观察细胞病变,判断药物抗病毒作用.结果:一清片2.55mg(生药)/ml浓度可抑制腺病毒3型、合胞病毒所致的细胞病变,但此浓度仅部分抑制腺病毒7型所致细胞的病变.结论:一清片对腺病毒3、7型及合胞病毒具有一定的抑制作用.
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姜黄素对与A549细胞共培养的肺成纤维细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制
目的 明确姜黄素对与A549细胞共培养的人胚肺成纤维细胞氧化应激水平的影响,进一步探讨姜黄素在防治肺纤维化方面可能的作用机制,寻求姜黄素干预肺纤维化的具体靶点.方法 将利用与A549细胞进行Transwell跨室共培养的人胚肺成纤维细胞分为5组:对照组、转化生长因子β1(TGF-β1,5 ng/mL)处理组、不同浓度姜黄素(5、10及20 μmol/L)进行干预的治疗组.应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞培养上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)；分光光度法检测细胞培养上清液丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平；流式细胞仪测定细胞内的活性氧(ROS)；Western blot法检测核蛋白核转录因子κB(NF-κB)的表达.结果 TGF-β1处理组细胞TNF-α浓度、ROS水平、MDA浓度及核内蛋白NF-κB表达均明显升高(P＜0.01),SOD水平明显下降(P＜0.01),说明人胚肺成纤维细胞在TGF-β1刺激下氧化应激水平明显升高.不同浓度姜黄素干预后TNF-α浓度、ROS水平、MDA浓度及核内蛋白NF-κB表达均明显降低(P＜0.01),SOD水平明显上升(P＜0.01).结论 低浓度姜黄素能够降低TGF-β1刺激的与A549细胞共培养的人胚肺成纤维细胞氧化应激水平,并显著增加SOD的表达,提示姜黄素可能通过降低氧化应激水平干预肺纤维化的发生、发展.
