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一例供精人工授精反复失败的精子蛋白质组学分析
目的 分析1例供精人工授精(AID)反复失败捐献者精子的蛋白质组成差异,探讨精子蛋白质组学变化与妊娠结局的相关性. 方法 1例连续9个AID周期失败的捐献者作为实验组；AID成功率在50％以上的3例捐献者作为对照组.收集两组精液样品,每位志愿者取3份精液,每次取精前禁欲3～7d,提取精子全蛋白,应用双向凝胶电泳分离精子蛋白,并行MALDI-TOF/TOF-MS质谱鉴定. 结果 实验组在分析区域内检测到432个蛋白点,对照组有460个蛋白点,两组中共有347个匹配蛋白点,匹配率达80.32％.检测到22个差异蛋白点,其中实验组有11个蛋白点高表达,8个蛋白点低表达,在对照组中3个蛋白点是缺失的. 结论 本研究利用蛋白质组学技术研究了1例AID反复失败供精者的精子蛋白质表达差异,发现22个差异蛋白点,其生物学意义有待进一步的研究.
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小鼠成熟卵丘-卵母细胞复合体蛋白质谱图的建立
目的通过聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术,全面展示小鼠成熟卵丘-卵母细胞复合体(COC)的蛋白质表达谱.方法采用13 cm pH3～10的非线性胶条进行双向凝胶电泳,分离成熟雌鼠COC总蛋白,并作质谱鉴定. 结果获得了较高分辨率的小鼠成熟COC蛋白质表达谱图,并对胶上的3个蛋白点进行了质谱鉴定. 结论蛋白质组学是全面分析COC蛋白表达的有效手段.成熟COC蛋白质表达谱的建立为研究卵泡发育机理提供了依据.
关键词： 双向凝胶电泳 质谱技术 卵丘-卵母细胞复合体 蛋白质谱图 -
血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化
蛋白质组学已成为生命科学研究的重点,是寻求疾病标志物的重要源泉.通过血清蛋白质组学研究,寻找特定疾病的血清特异蛋白质标志物或发现新的疾病相关蛋白质,能为疾病的诊断或治疗提供新的依据,也可能进一步阐明一些复杂疾病的发病机制.自1975年O′Farrell[1]提出高分辨率双向电泳技术以来,该技术有了长足的发展,并与质谱技术、生物信息学技术成为蛋白质组学研究的三大核心技术 .
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双向电泳-质谱技术筛选心绞痛血瘀证相关蛋白的研究
目的 对心绞痛血瘀证患者血瘀证程度变化前后的血浆进行双向电泳图谱检测,寻找心绞痛血瘀证相关蛋白,探索心绞痛血瘀证的蛋白质组学特点.方法 采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱对8例心绞痛血瘀证患者血瘀证程度变化前后的血浆进行比较蛋白质组学研究,寻找心绞痛血瘀证相关蛋白.结果 初步发现了Clustenin、ApoA-I在血瘀证程度变轻后表达增加,而Fibrinogen β chain、Vitamin D-Binding Protein、Haptoglobin β chain、Albumin isofom在血瘀证程度变轻后表达降低.结论 初步发现Clusterin、ApoA-I、Fibrinogen β chain、Vitamin D-Binding Protein、Haptoglobin β chain、Albumin isoform可能与心绞痛血瘀证相关,但结果有待运用其他生物学的方法进行具体的验证并探索其机制.
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苦碟子注射液作用后缺血性脑卒中火毒证大鼠脑组织双向电泳技术的建立与优化
目的 建立和优化苦碟子注射液作用后缺血性脑卒中火毒证大鼠脑组织蛋白质组双向电泳技术.方法 采用标准裂解法提取苦碟子注射液作用后缺血性脑卒中火毒证大鼠病灶侧梗死周边区大脑皮层组织总蛋白,分别利用三氯乙酸-丙酮沉淀法和去脂蛋白纯化法处理蛋白质样品,进行双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE),并对蛋白上样量和等电聚焦参数进行优化,考马斯亮蓝染色后对凝胶图像进行比较.结果 去脂蛋白纯化法所得蛋白的2-DE图谱蛋白点数目明显增加,蛋白纯化效果较好,具有更好的溶解性和重复性;等点聚焦参数经改进后,所得图谱的分辨率较高,分离更完全;样品上样量为1 000 μg时较适合,图谱蛋白点数目多、形状圆滑,且仅有几个高丰度蛋白出现点饱和.结论 成功建立了苦碟子注射液作用后缺血性脑卒中火毒证大鼠脑组织蛋白质提取纯化方法,优化了双向电泳体系,从而获得更清晰的2-DE图谱,为后续研究奠定了技术基础.
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基于双向凝胶电泳技术的中医寒、热体大鼠蛋白质组表达谱研究＊
目的：利用双向凝胶电泳技术对中医寒、热体大鼠进行蛋白质组表达谱研究，以期寻找与寒热体相关的蛋白质，并探讨中医寒、热体形成的生物学基础。方法：提取大鼠肝脏细胞的总蛋白，采用双向凝胶电泳（2-DE）及MALDI-TOF-MS质谱技术筛选并鉴定寒热体表达差异的蛋白质群。结果：经过筛选和质谱技术共获得10个具有统计学意义的蛋白表达差异点：氨甲酰磷酸合成酶、二硫键异构酶、过氧化氢酶、过氧化氢异构酶、细胞质氨肽酶、谷氨酸脱氢酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶、热休克蛋白前体、同型半胱氨酸、葡萄糖调节蛋白前体。结论：中医寒热体大鼠在蛋白质组表达方面存在一定的差异性，酶类蛋白代谢异常可能是寒热体形成的物质基础之一。
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蛋白质组学在肝损伤本质研究中的应用现状及策略
查阅Pubmed、CNKI等国内外相关研究资料30篇并对其进行汇总和分析.①蛋白质组学技术已应用于药源性肝损伤(DILI)、四氯化碳(CCl4)肝损伤、酒精性肝损伤、脂多糖(LPS)肝损伤、免疫性肝损伤、硫代乙酰胺肝损伤、放射性肝损伤、溴苯肝损伤、肼肝损伤、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等多种类型肝损伤本质研究中,其中尤以在DILI中的应用为多见；②测试用蛋白样品主要取自动物肝和血清,偶亦用到尿液、胆汁酸、线粒体等；③双向凝胶电泳(2-DE)、MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)和多级MS是其主要分析工具；④肝损伤的蛋白质组机制研究广度和深度有待加强；⑤药物保肝作用的蛋白质组本质研究相对较少.应加强蛋白质组学在肝损伤本质研究中应用的深度,以促进肝损伤本质的全面揭示；应加强蛋白质组学在药物保肝本质研究中的应用力度,从而为保肝药物的科学应用提供更深入更全面的科学依据.
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脾阴虚证大鼠海马蛋白质组双向凝胶电泳的研究
目的:应用双向凝胶电泳方法初步分析脾阴虚证大鼠海马蛋白质组的表达,为进一步探讨脾阴虚所致脑损伤的分子机制提供依据.方法:采用饮食不节、劳倦过度联合耗伤阴液法建立脾阴虚证大鼠模型,对脾阴虚组和空白对照组海马蛋白质组表达进行比较,观察分析其差异.结果:脾阴虚组出现易激惹、咬斗,肛温升高,饮水量增加等脾阴虚表现(P<0.05).通过双向凝胶电泳图谱比较发现脾阴虚组海马蛋白质组中有6个蛋白点表达发生明显改变.其中5个蛋白点表达明显下调,1个表达显著上调.结论:应用双向凝胶电泳方法初步筛选出脾阴虚大鼠海马蛋白质组的差异表达,推测与学习记忆相关.
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亚硫酸氢钠穿心莲内脂对小鼠肾毒性及其蛋白表达分析
目的:观察亚硫酸氢钠穿心莲内脂(ASB)的肾毒性机制.方法:20只雄性ICR小鼠随机分为正常对照组和ASB组(1 000mg/kg),每组10只.小鼠尾静脉注射ASB,每天1次,连续7d,正常对照组用等体积0.9％氯化钠溶液同条件予以注射.进行血常规、血液生化指标及肾病理组织学检查.另取一肾提取蛋白质进行双向凝胶电泳分离找出差异蛋白点.结果:ASB组,外周血白细胞从(1050±2.00)×109/L升高至(13.70±3.40)×109/L,血小板从(666.05±122.09)×109/L降低至(451.31±207.22)×109/L,淋巴细胞比例从(0.83±0.03)降低至(0.68±0.11);血清尿素氮、肌酐异常升高(P＜0.05);其中8只小鼠出现肾脏病变,多为肾小管间质炎症细胞浸润(间质性肾炎).肾组织蛋白经双向电泳后,ASB组与正常对照组比较有8个差异蛋白点:2个表达增强,2个表达降低,新出现2个,消失1个,移位1个,有显著性差异变化(P＜0.05).结论:在通过肾组织蛋白表达分析后,ASB所致小鼠急性肾损伤且组织有明显不同蛋白差异点表达,这些差异蛋白质可能参与了ASB肾毒性损伤的过程.
关键词： 亚硫酸氢钠穿心莲内脂 肾毒性 机制 双向凝胶电泳 -
大肠癌虚实证候与蛋白质差异性表达的研究
目的:研究大肠癌虚证(气血亏虚)和实证(湿热蕴结)蛋白质差异性表达,从蛋白质水平上探讨大肠癌虚实证的本质.方法:用双向凝胶电泳分离虚实证大肠癌蛋白质,银染,PDQuest 2-DE软件分析,对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱,查询SWISS-PROT、NCBI数据库.结果:获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱,共筛选出23个差异蛋白点,其中有21个差异蛋白质得到鉴定,这些蛋白包括热休克蛋白、细胞骨架蛋白、抗氧化蛋白、信号转导相关蛋白、能量产生相关蛋白、血液蛋白等.结论:初步建立了大肠癌虚实不同证型-蛋白质表达谱,为研究大肠癌虚实不同证型的本质提供了物质基础.
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消痰散结方对裸鼠人胃癌MKN-45皮下移植瘤模型血清蛋白质组表达的影响
目的 观察消痰散结方对裸鼠人胃癌MKN-45皮下移植瘤模型血清蛋白质组表达的影响.方法 30只BALB/c-nu/nu裸鼠随机分为正常组、模型组、干预组,采用瘤块接种方法造模.正常组自由饮食,模型组、干预组分别给予生理盐水、消痰散结方灌胃.运用蛋白质组学的双向凝胶电泳技术,观察3组之间的血清蛋白质组表达差异,筛选出与消痰散结方作用相关的差异表达蛋白质,并对其进行质谱鉴定,确认差异表达蛋白质的身份.结果 去除血清中高丰度蛋白质后获得分辨率高、重复性稳定性好的血清2-DE图谱.与正常组比较,模型组中找到25个差异表达蛋白点,其中12个表达上调,13个表达下调.与模型组比较,干预组中找到19个差异表达蛋白点,其中14个表达上调,5个表达下调.3组间比较共找到差异表达蛋白点9个,与正常组比较,在模型组中表达上调、在干预组表达回调至正常组水平的3个,终鉴定为结合珠蛋白、泛素蛋白连接酶、组蛋白甲基转移酶;与正常组比较,在模型组中表达下调、在干预组表达回复至正常组水平的有6个,其中3个鉴定为载脂蛋白A1、过氧化物酶1、超氧化物歧化酶.结论 消痰散结方对载脂蛋白A1、过氧化物酶1等功能蛋白表达的综合性调节可能是其发挥抗胃癌作用的重要机制.
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中医不同证型帕金森病患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究
目的 研究中医肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)的比较蛋白质组差异,从蛋白表达水平上探讨中医肝阳化风证和血虚生风证的本质.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人PBMC总蛋白质,考马斯亮蓝染色,PDQuest 2-DE软件分析,对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱,用Mascot查询系统查询SWISS-PROT数据库.结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳考染图谱,对其中的15个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析,经数据库查询,初步鉴定为一些与细胞骨架,抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、细胞周期调控等有关的蛋白质.结论 建立了帕金森病肝阳化风证和血虚生风证PBMC的双向凝胶电泳图谱,提示帕金森病肝阳化风证和血虚生风证患者和正常人的PBMC的蛋白质表达具有差异,这种蛋白质组的差异分析有助于为研究肝阳化风证和血虚生风证本质在蛋白质水平上提供物质基础.
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基于血清蛋白组学初步探讨脑心通胶囊防治心脑血管疾病的作用机制
步长脑心通胶囊具有益气活血,化瘀通络的作用,临床广泛用于冠心病、心绞痛、脑卒中等心脑血管疾病的治疗,其预防的药效物质基础及可能作用机制尚不明确.该实验取C57BL/6小鼠20只,雌雄各半,按体重随机分为对照组(生理盐水)和脑心通组.适应性喂养7d后开始给药,连续灌胃3d,末次给药后1h,心尖取血,每组取6只制备血清蛋白样品,进行双向凝胶电泳,图像分析,质谱检测,筛选并鉴定差异表达蛋白,对差异蛋白进行生物信息学分析.脑心通胶囊给药组与对照组差异表达蛋白24个,其中与对照组相比,上调12个,下调12个.差异蛋白所参与的通路涉及细胞凋亡信号通路,血管内皮生长因子信号传导通路等,其中vasohibin-1是血管生成的负反馈调节因子,Western blot结果证实脑心通胶囊可使vasohibin-1蛋白表达降低,与双向电泳结果一致.脑心通胶囊给药组血清蛋白表达有差异,差异蛋白的主要作用靶位为内皮细胞、炎症细胞及血小板等,这些蛋白的改变提示脑心通胶囊在一定程度上可以改善冠心病及缺血性脑血管疾病,为脑心通胶囊未病先防的分子机制研究提供了潜在的生物标志物.
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类风湿关节炎寒湿痹阻证患者血清蛋白组学分析
目的 从蛋白质表达水平初步探讨类风湿关节炎中医寒湿痹阻证的本质内涵.方法 选择24例2009年7月-2010年9月南京中医药大学附属医院风湿免疫科类风湿关节炎(RA)患者,按中医辨证分型分为寒湿痹阻证组和湿热痹阻证组,每组12例,另选择本院体检中心健康志愿者12名作为正常对照组.采用双向凝胶电泳技术分析各组蛋白图谱,分别比较寒湿痹阻证组和其他两组图谱,找出共同的寒湿痹阻证差异蛋白质点,应用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行鉴定.采用Mascot 软件在SwissProt数据库中搜索肽质量指纹谱数据并确定蛋白质.结果 寒湿痹阻证组与正常对照组差异蛋白质点共有81个;寒湿痹阻证组与湿热痹阻证组差异蛋白质点共有45个;有13个蛋白点是寒湿痹阻证组较其他两组蛋白表达量均高或均低的蛋白点;通过质谱鉴定和数据库检索获得9个差异蛋白质.这些差异蛋白大多与细胞增殖、细胞分化等细胞事件的抑制相关.结论 4.1蛋白、DLC-1蛋白等与细胞增殖和细胞分化相关蛋白具有潜在的作为类风湿关节炎寒湿痹阻证诊断、预后标志物或治疗靶点的意义,也为进一步研究寒湿痹阻证实质提供了依据.
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健胃愈疡颗粒对乙酸性胃溃疡复发大鼠作用的蛋白质组学研究
目的 分析健胃愈疡颗粒(JWYY)对乙酸性胃溃疡复发大鼠蛋白质表达谱的影响,寻找JWYY抗胃溃疡复发作用的相关蛋白.方法 采用二维凝胶电泳(2-DE)分离JWYY处理组和JWYY未处理组大鼠胃组织的总蛋白,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图,NCBInr及SWISS-PROT数据库搜索鉴定蛋白质.结果 所获2-DE图谱分辨率高、重复性好,质谱分析共鉴定了12个差异蛋白质点,其中JWYY处理组有8个蛋白质点表达上调,4个蛋白质点表达下调,大多数蛋白与溃疡复发的形成、生长、凋亡及免疫等环节相关.结论 JWYY抗胃溃疡复发作用可能与多种蛋白直接或间接相关,这些蛋白质的鉴定及进一步研究有助于抗溃疡复发药物新型靶标的发现.
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质谱技术分析多发性骨髓瘤患者血清差异蛋白
目的 应用双向电泳(2-DE)和质谱技术分析多发性骨髓瘤(MM)患者血清中的差异表达蛋白,寻找MM特异性蛋白标记物.方法 收集MM患者5例、其他血液系统恶性肿瘤患者及正常对照者血清各10例,三组样本等体积混合,去除高丰度白蛋白和IgG,应用2-DE分离3组血清样本,凝胶经银染显色和图像数据分析识别差异蛋白质点,以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对差异蛋白质点进行鉴定.结果 通过凝胶软件分析MM与疾病对照组及正常对照组血清2-DE图谱,共得到51个三倍以上差异蛋白点,对上述差异蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱分析,共鉴定出22种阳性蛋白,其中13种蛋白表达上调,包括高表达蛋白如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RIO1亚型2、Rab相关蛋白Rab37亚型2、HP蛋白、锌指结构α2糖蛋白等；9种蛋白表达下调,包括α2-HS-糖蛋白、转铁蛋白、多聚素-1等.结论 MM组与疾病对照组和正常对照组间存在差异表达的蛋白质,这些差异蛋白有助于MM早期诊断和鉴别诊断,并为MM发病机制的进一步研究提供线索.
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双向凝胶电泳在临床血浆蛋白质组学研究中的技术难点和解决方法
随着双向电泳技术中固相化pH梯度的发明、电喷雾质谱、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术的应用,蛋白质组学技术已经越来越多的应用于疾病的研究中.临床蛋白质组学已经成为目前医学研究中的热点[1].血液标本因取材简便、应用价值高,因此血浆蛋白质组学具有应用前景,并成为临床蛋白质组学研究中关注的重要问题.
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基于触珠蛋白变化的白血病干细胞移植治疗疗效初探
目的 探讨不不同的干细胞移植法对白血病患者血浆触珠蛋白(Hp)变化的影响.方法 以4例进行间充质干细胞和造血干细胞共移植(MSC/HSCT)的患者和2例采用造血干细胞移植(HSCT)的患者为研究对象,运用双向凝胶电泳(2-DE)对其不同治疗阶段的血浆中的触珠蛋白进行分离,利用MALDI-TOF/TOF MS进行鉴定.结果 治疗过程中触珠蛋白β链和α链的血浆含量在移植后呈现明显的递减趋势,并伴有多种翻译后修饰,这种变化趋势在MSC/HSCT治疗的患者中更为显著.结论 触珠蛋白有可能成为白血病干细胞移植治疗疗效评价及疗程监测的标志物.
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华蟾素注射液抗肝癌细胞多药耐药性的蛋白质组学分析
目的 在蛋白表达水平上探讨华蟾素注射液对抗人肝癌多药耐药的机制.方法 体外培养人肝癌耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-7402/FU,MTT法测定华蟾素注射液细胞毒性及耐药逆转作用.双向凝胶电泳与质谱技术检测0.26 mg/L华蟾素注射液作用于耐药细胞株前后的差异表达蛋白,Western blot验证质谱鉴定的蛋白FAK、CRT和TMOD3表达情况.结果 华蟾素注射液对细胞Bel-FU的IC5o为0.66 mg/L,浓度为0.08、0.16及0.32 mg/L华蟾素注射液的耐药逆转倍数分别为1.56、2.18及2.99倍;0.26 mg/L华蟾素注射液作用后,耐药细胞中13个蛋白点表达下调,另有1个蛋白点表达上调.华蟾素注射液下调耐药细胞中FAK、CRT和TMOD3表达与双向凝胶电泳及质谱技术检测的差异表达蛋白变化一致.结论 华蟾素注射液可引起耐药相关蛋白表达变化而逆转多药耐药.
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5-FU诱导人肝细胞癌MDR的比较蛋白质组学研究
目的 寻找与人肝细胞癌多药耐药相关的蛋白质分子,为进一步研究人肝细胞癌多药耐药机制提供依据.方法 体外培养人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶(5-FU)细胞Bel-FU,MTF法检测Bel-FU的多药耐药性,双向凝胶电泳技术分析细胞Bel-7402与Bel-FU之间的差异表达蛋白,经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定.Western blot验证2-DE及质谱的检测结果.结果 与Bel-7402比较,Bel-FU中有24个蛋白表达上调,其中包括FAK、TM3、ORP150、CRT、hnRNP K、80K-H protein、EF-1-D、phosphoprotein等,12个蛋白表达下调.Western blot法检测到蛋白FAK、CRT在Bel-FU中高表达,与2-DE结果一致.结论 通过建立人肝癌细胞Bel-7402及其耐5-氟尿嘧啶细胞Bel-FU的2-DE图谱筛选了多药耐药相关的差异蛋白,为人肝细胞癌MDR的分子机制研究奠定了基础.
