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冬凌草甲素抗肿瘤分子药理机制研究进展
冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米亚Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara的干燥全草,具有清热解毒、消炎止痛、抗肿瘤之功效,用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎,对食管癌、肝癌、肺癌等多种癌症患者有缓解症状并延长生存时间的作用.冬凌草甲素(Oridonin,Ori)是从冬凌草中提取出来的一种二萜类化合物,占冬凌草有效成分的90%以上,是抗肿瘤的主要活性成分.体外药效学研究显示,冬凌草甲素对多种人癌细胞株的生长有明显的抑制作用[1,2].本文就冬凌草甲素的抗肿瘤分子药理机制研究进展作一综述.
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冬凌草甲素对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其机制研究
目的:研究冬凌草甲素(ORI)对人结肠癌细胞株HCT116生长的影响及其可能机制.方法:以体外培养的HCT116细胞为研究对象,给予不同浓度(0、2.5、5、10、20 μ M)ORI处理HCT116细胞不同时间(0、24、48、72h),通过MTT法检测其对HCT116细胞增殖的影响,DAPI染色观察其对细胞核的形态的影响,western blot检测细胞内β-catenin、c-myc蛋白表达的变化.结果:①ORI可显著抑制HCT116细胞的增殖,且此作用随着浓度和作用时间的增加或延长而增强(P＜0.05).②ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞核固缩的百分率随药物作用浓度的增加而增加.③5、10、20μM ORI处理HCT116细胞24小时后,细胞内的β-catenin、c-myc蛋白水平均显著下调,且随着ORI浓度的增加逐渐减少.结论:ORI能以浓度和时间依赖性的方式抑制HCT116细胞的增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关.
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冬凌草甲素抗肿瘤机制的研究进展
近几十年来,冬凌草的药用价值不断受到国内外研究者的关注.其中主要成份冬凌草甲素对多种肿瘤细胞株具有抑制作用,且功效显著毒性较低.冬凌草甲素主要抗癌机制是通过抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡来发挥作用.本文主要对冬凌草甲素的作用机制做一综述.
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中压柱层析法提取分离冬凌草甲素的新工艺
采用中压柱层析法提取分离冬凌草甲素,具有洗脱速度快,分离效率高,溶剂无毒无污染,安全、价廉、易得等优点.经重结晶后用薄层扫描法测定含量达99.28%,是一种简便易行的方法.
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中压柱层析法提取分离冬凌草甲素的新工艺
采用中压柱层析法提取分离冬凌草甲素,具有洗脱速度快,分离效率高,溶剂无毒无污染,安全、价廉、易得等优点.经重结晶后用薄层扫描法测定含量达99.28%,是一种简便易行的方法.
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冬凌草甲素对肿瘤转移相关酶的影响
目的 探讨冬凌草甲素对肿瘤转移相关酶(乙酰肝素酶,MMP-2,MMP-9)的影响.方法 利用半定量RT-PCR检测乳腺癌MDA-MB-231细胞乙酰肝素酶基因的表达变化,用明胶酶谱检测冬凌草甲素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞MMP-2、MMP-9活性的影响.结果 冬凌草甲素可下调乙酰肝素酶在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达,并抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性.结论 冬凌草甲素可通过下调乙酰肝素酶基因表达、抑制MMP-2和MMP-9活性,从而抑制肿瘤的侵袭转移.
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冬凌草甲素超声提取与纯化工艺
目的 优化冬凌草甲素超声提取工艺,并探讨其纯化工艺.方法 HPLC法测定冬凌草甲素含有量,Box-Behnken设计考察超声时间、超声温度和液料比对提取率的影响,硅胶柱层析结合重结晶法进行纯化.结果 佳条件为超声时间30 min,超声温度50℃,液料比25∶1,提取率为4.79 mg/g.石油醚-丙酮梯度洗脱结合重结晶法可得到含有量99.17％的冬凌草甲素.结论 该方法提取率高,纯化效果好,可用于冬凌草甲素的超声提取和纯化.
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UPLC测定超声提取冬凌草中冬凌草甲素的含量
目的:建立了超高效液相色谱法测定冬凌草中冬凌草甲素的方法.方法:以甲醇作溶剂,超声提取40min,提取液经0.22μm滤膜过滤后,采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),乙腈-水为流动相梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温40℃,PDA检测器于242 nm波长下对冬凌草中甲素的含量进行测定.结果:冬凌草甲素在0.022～0.44μg范围内有良好的线性关系(r=0.999 7),平均回收率为97.3%,RSD 1.05%.结论:该方法便捷,结果稳定、准确,可用于为冬凌草相关产品的质量控制及评价.
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HPLC切换波长法同时测定冬凌草片中迷迭香酸和冬凌草甲素含量
目的:建立冬凌草片中迷迭香酸和冬凌草甲素的含量测定方法,为冬凌草片质量标准的研究提供科学依据.方法:采用高效液相色谱切换波长法同时测定冬凌草片中迷迭香酸和冬凌草甲素的含量.色谱条件为phenomsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)柱,流动相:甲醇-0.3%磷酸水溶液(40:60);检测波长:前21 min为329 nm,21 min后为238 nm.结果:此方法线性良好,迷迭香酸和冬凌草甲素的平均加样回收率分别为97.8%,96.7%;RSD分别为1.9%.2.3%.结论:本方法精密度高,分离度良好,可用于测定冬凌草片中迷迭香酸和冬凌草甲素的含量.
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冬凌草甲素对人肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制作用及其作用机制
目的:探讨冬凌草甲素对肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制作用及其作用机制.方法:以不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的BEL-7402细胞,MTT法检测细胞生长抑制率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡,Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡时的形态学变化.应用PCR-ELISA及RT-PCR法检测细胞凋亡前后端粒酶活性及端粒酶hTERT mRNA表达水平的变化.结果:冬凌草甲素可显著的抑制BEL-7402细胞的生长,诱导细胞发生凋亡,并呈现出明显的量-效与时-效关系.冬凌草甲素作用48～60h后在Hoechst 33258荧光染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡特征,同时端粒酶hTERT mRNA的表达水平及端粒酶活性均明显降低.结论:冬凌草甲素能抑制BEL-7402细胞的生长及诱导细胞发生凋亡;降低端粒酶hTERT mRNA的表达水平及端粒酶活性可能是其重要作用机制之一.
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冬凌草甲素对HL-60细胞的诱导凋亡作用及其作用机制
目的:探讨冬凌草甲素对白血病HL-60细胞的诱导凋亡作用及其作用机制.方法:以不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的HL-60细胞,应用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡,TRAP-PCR-ELISA及FCM法检测细胞凋亡前后端粒酶活性及P53蛋白表达水平的变化.结果:8 umol/L以上的冬凌草甲素对HL-60细胞具有显著的诱导凋亡及增殖抑制作用,并呈现出明显的量-效与时-效关系.药物作用48小时后细胞的凋亡率达高峰,在Hoechst染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的凋亡改变.在细胞凋亡过程中,端粒酶活性下降,同时P53蛋白的表达水平显著升高.结论:冬凌草甲素对HL-60细胞具有显著的诱导凋亡及增殖抑制作用,升高P53蛋白的表达水平及降低细胞端粒酶活性可能是其重要作用机制之一;这为冬凌草甲素进一步应用于临床治疗急性白血病提供了有力的试验依据.
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冬凌草甲素对NB4细胞的诱导凋亡机制
目的:研究冬凌草甲素对急性白血病NB4细胞的诱导凋亡作用,并对其作用机制进行探讨.方法:以不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的NB4细胞,检测细胞生长抑制率,观察细胞凋亡时的形态学变化,对细胞凋亡前后的Caspase3活性进行检测.结果:冬凌草甲素可显著的升高NB4细胞Caspase3活性,抑制细胞的生长,诱导细胞发生凋亡.并呈现出明显的量-效与时-效关系.结论:冬凌草甲素能诱导NB4细胞凋亡,升高Caspase3活性是其重要作用机制之一.
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冬凌草甲素结肠定位柱塞型脉冲释药胶囊的制备
目的 制备时间控制型冬凌草甲素结肠定位柱塞型脉冲释药胶囊.方法 灌注法制备非渗透性囊体,粉末直接压片法压制柱塞片.以PEG6000和PEG4000为基质,制备冬凌草甲素滴丸.用柱塞片将滴丸密封于非渗透性囊体内,制备脉冲释药胶囊.结果 冬凌草甲素结肠定位柱塞型脉冲释药胶囊在体外呈明显的脉冲释放,当缓释骨架材料HPMC K15M和乳糖的比例为1∶8时,可达到结肠定位所需的5～6h释药时滞.结论 调节柱塞片HPMC K15M和乳糖的比例可获得具有适当释药时滞的冬凌草甲素脉冲释药胶囊.
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冬凌草分散片溶出度测定方法的研究
目的:建立冬凌草分散片的体外溶出度测定方法,以控制其产品质量.方法:溶出介质为0.1 mol/L盐酸溶液,转速100 r/min,桨法.流动相为甲醇-水(50∶50),检测波长240 nm.结果:3批样品,平均溶出度为95.74%.结论:该方法可以用于测定冬凌草分散片中冬凌草甲素的溶出度.
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冬凌草甲素增强对小鼠H22肝癌细胞免疫杀伤作用的实验性研究
为阐明冬凌草甲素(ORI)抗小鼠H22肝癌中的T细胞免疫应答机制,本研究利用C57/BL6小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型,随机分为荷瘤对照组(PBS组)、ORI高、中、低剂量处理组(75、50、25 mg·kg1·d-1)、阳性对照组(5-Fu组)和空白组(NC组),连续腹腔注射给药12d后处死.以瘤重、抑瘤率观察ORI对移植瘤生长的影响;用乳酸脱氢酶释放法检测对小鼠H22细胞杀伤活性;流式细胞术检测小鼠脾脏细胞中CD4+T细胞分泌IL-17、IL-2 、TNF-α、IFN-γ等细胞因子能力,并检测CD8+T和CD4+T细胞表面PD-1的表达.结果显示:低、中、高剂量ORI处理组和荷瘤对照组比较均有显著性缩小(P＜0.05);ORI能明显提高荷瘤小鼠脾脏细胞对H22细胞的杀伤活性(P＜0.05);抑制CD4+T细胞中细胞因子的分泌,尤其对IL-17和IL-2的抑制为明显,对TNF-α和IFN-γ抑制在ORI高浓度情况下发挥作用;同时,ORI处理组中CD8+T细胞的PD-1表达降低,而CD4+T细胞表面PD-1的表达呈现一定程度的上调.上述结果表明ORI对小鼠H22肿瘤具有明显的体内抑瘤作用,除了直接的杀伤作用外,ORI还可以通过提高CD8+T的杀伤作用,降低CD4+T细胞的炎症特性发挥抗肿瘤免疫应答功效,其中的可能机制是影响两种细胞表面PD-1的表达.因此,ORI还可通过协同T细胞抗肿瘤免疫应答机制促进对肿瘤的抑制作用.
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阿糖胞苷联合冬凌草甲素诱导U937细胞株凋亡的初步研究
目的:探讨阿糖胞苷联合冬凌草甲素诱导白血病细胞株U937凋亡的作用.方法:用阿糖胞苷和冬凌草甲素单药或两药联合处理U937细胞后,采用细胞计数检测细胞增殖,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术分析细胞磷脂酰丝氨酸外翻情况和线粒体膜电位变化,蛋白印迹法检测凋亡相关分子表达情况.结果:阿糖胞苷和冬凌草甲素单药均能抑制U937细胞增殖,而两药联合抑制作用更加明显,两者能协同诱导U937细胞凋亡,并明显促进细胞磷脂酰丝氨酸外翻和线粒体跨膜电位下降;两药联合较单药组还能明显诱导Caspase-9、Caspase-3活化及PARP的剪切.结论:阿糖胞苷与冬凌草甲素能够协同抑制U937细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能是主要通过线粒体途径介导.
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冬凌草甲素诱导人多发性骨髓瘤ARH-77细胞凋亡及其可能机制
目的:探讨冬凌草甲素(oridonin,Ori)对人多发性骨髓瘤ARH-77细胞的致凋亡作用及其可能的机制.方法:不同浓度Ori(2.5、5、10 μmol/L)作用于ARH-77细胞,MTT法检测ARH-77细胞的增殖,相差显微镜和Hoechst 33258染色观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测ARH-77细胞的早期凋亡及线粒体膜电位(Δψm)的变化,caspase 8凋亡试剂盒检测ARH-77细胞caspase 8的活化.结果:Ori对ARH-77细胞的生长有明显的抑制作用,且呈时间和剂量依赖性.10 μmol/L Ori作用于ARH-77细胞24 h后可见细胞变小、胞质中出现空泡,并可见凋亡小体.流式细胞术结果显示,经不同浓度Ori(2.5、5、10 μmol/L)处理后,细胞早期凋亡率分别为(15.07±0.78)%、(21.00±1.49)%和(27.45±2.47)%,均高于对照组的(5.27±1.46)%(P<0.01).不同浓度Ori(2.5、5、10 μmol/L)处理后,反映Δψm的绿色荧光细胞百分率分别为(26.80±0.75)%、(36.81±2.27)%和(49.48±1.10)%,均高于对照组的(16.96±0.50)%(P<0.01),提示ARH-77细胞凋亡有显著增加.同时,Ori处理可上调ARH-77细胞caspase 8的活性(P<0.01).结论:冬凌草甲素能明显诱导多发性骨髓瘤ARH-77细胞的凋亡,其机制可能与激活内、外源凋亡通路有关.
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冬凌草甲素联合塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响
目的:检测二萜类化合物冬凌草甲素联合环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,Cox-2)抑制剂塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响,并探讨可能的作用机制.方法:MTT法检测不同浓度的冬凌草甲素(20、40和60 μmol/L)和塞来昔布(25、50和100μmol/L)单药和联合处理12和24 h后MG-63细胞的增殖抑制率;FCM法检测冬凌草甲素(40 μmol/L)和塞来昔布(50μmol/L)单药和联合干预MG-63细胞后的凋亡率,并分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测对Cox-2以及凋亡调节因子[B细胞性淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和生存素(survivin)] mRNA及蛋白表达水平的影响.结果:不同浓度的冬凌草甲素和塞来昔布单药和联合干预后,MG-63细胞的增殖明显受到抑制(P值均＜ 0.05),呈剂量依赖性,且在低剂量和中剂量时两药有协同作用.冬凌草甲素和塞来昔布联合用药组较空白对照组和各单药组细胞的凋亡率增加(P值均＜ 0.05).联合用药组中Cox-2、Bcl-2和survivin mRNA及蛋白的表达水平均较空白对照组和各单药组明显下调(P值均＜ 0.05),而Bax mRNA及蛋白的表达水平明显上调(P值均＜0.05).结论:冬凌草甲素联合塞来昔布可协同抑制MG-63细胞,这一过程可能与Cox-2的表达受到抑制和凋亡调节因子表达水平的改变有关.
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冬凌草甲素纳米粒的制备及其在大鼠体内的药动学研究
目的:制备冬凌草甲紊纳米粒,考察其在大鼠体内的药动学行为.方法:采用乳化超声-溶剂蒸发法制备荷载冬凌草甲素的聚乳糖-羟基乙酸(PLGA)纳米粒,通过粒径及多分散指数测定、外观形态的透射电镜观察、包封率及载药量分析等,对纳米粒进行体外理化性质测定.以大鼠为模型动物,尾静脉注射冬凌草甲紊PLGA纳米粒,采用HPLC法测定其血药浓度,利用DAS软件分析其药动学特征.结果:所制备的冬凌草甲素PLGA纳米粒平均粒径为180 nm,包封率为(87.7±7.7)％,载药量为(7.5±0.8)％,其外观形态为圆球形.单剂量静脉注射冬凌草甲素PLGA纳米粒后在大鼠体内呈二室模型分布.其主要的药动学参数如下:分布半衰期(t1/2α)为2.115 h,消除半衰期(t1/2β)为69.315 h,血药浓度曲线下面积(AUC)为42.463 mg·h·L-1,清除率(CL)为0.094 L· h-1·kg-1,表观分布容积(V)为0.4 L/kg.结论:本研究建立的冬凌草甲素PLGA纳米粒制备工艺简单、可行,包封率较高,制备成PLGA纳米粒后可以改善冬凌草甲素的生物利用度.
关键词： 冬凌草甲素 聚乳糖-羟基乙酸纳米粒 药代动力学 -
参仙灵颗粒的成分鉴别及冬凌草甲素和人参皂苷Rg1的含量测定
目的:修订提高解放军第八一医院院内制剂参仙灵颗粒的质量标准,保障在消化道肿瘤病人辅助治疗中的疗效和安全性.方法:在对参仙灵颗粒原有检测方法验证的基础上,完善了仙鹤草、乌梅、甘草、绞股蓝、人参、灵芝的薄层色谱(TLC)鉴别方法;采用HPLC法测定参仙灵颗粒中冬凌草甲素和人参皂苷Rg1的含量.结果:TLC斑点清晰,阴性对照无干扰,专属性强.参仙灵颗粒中冬凌草甲素在0.0156~2.00μg范围内线性关系良好(r=0.9998),平均回收率为96.0%~99.5%(RSD=1.08%,n=6).人参皂苷Rg1在0.0009~0.24μg范围内线性关系良好(r=0.9996),平均回收率为99.1%~104.7%(RSD=2.62%,n=6).结论:本方法简便,专属性强,重现性好,结果准确,可作为参仙灵颗粒的质量控制标准.
