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丁酸钠通过Ca2+-CaMKKβ信号通路诱导结直肠细胞自噬
目的 研究丁酸钠(sodium butyrate,NaB)诱导结直肠癌细胞HCT-116自噬的分子机制.方法 免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测NaB诱导结直肠癌细胞自噬标志蛋白微管相关蛋白1A和1B (microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3)的蛋白与mRNA表达水平,以及免疫印迹法检测钙调素依赖蛋白激酶的激酶β (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase β,CaMKKβ)的磷酸化蛋白表达水平;免疫印迹法检测RNAi下调CaMKKβ表达对NaB诱导结直肠癌细胞自噬的影响;免疫印迹法和荧光定量PCR检测细胞内钙离子螯合剂(BAPTA-AM)对NaB诱导结直肠癌细胞自噬的影响,以及免疫印迹检测其对p-CaMKKβ蛋白表达水平的影响.结果 NaB可上调LC3-Ⅱ蛋白与mRNA表达水平,即诱导结直肠癌细胞自噬;NaB可诱导CaMKKβ蛋白磷酸化;RNAi下调CaMKKβ表达可显著抑制NaB诱导的LC3-Ⅱ蛋白的表达,即抑制NaB诱导的结直肠癌细胞自噬;BAPTA-AM预处理可抑制NaB诱导的CaMKKβ蛋白磷酸化以及下调LC3-Ⅱ蛋白与mRNA表达水平.结论 NaB可通过Ca2+-CaMKKβ信号通路诱导结直肠细胞自噬.
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硫化氢对短暂脑缺血/再灌注老年大鼠海马神经元Camkkβ、Bcl-2和Bax表达的影响
目的 探讨硫化氢对短暂脑缺血再灌注老年大鼠海马神经元Camkkβ、Bcl-2和Bax表达的影响.方法 健康雄性SD老龄大鼠120只,随机分为对照组(C组)、缺血/再灌注组(IR组)、H2S组(H组)和生理盐水组(S组),采用Pusinelli四动脉阻断法建立全脑缺血模型.H组缺血前10 min腹腔内注射H2S外源性供体NaHS;S组注入等量生理盐水;C组不行任何处理.大鼠脑缺血/再灌注后24 h进行神经行为学评分;脑缺血/再灌注后1、3、5d采用TUNEL法检测神经元的凋亡情况,采用Western-blot法测定大鼠海马内Camkkβ、Bcl-2和Bax蛋白表达.结果 与对照组比较,缺血/再灌注组老年大鼠脑缺血/再灌注24 h后神经行为学评分升高,海马TUNEL阳性神经元计数升高,Camkkβ表达升高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调(P＜0.05);与缺血/再灌注组比较,H2S组老年大鼠脑缺血/再灌注24 h后神经行为学评分降低、海马区TUNEL阳性神经元计数降低、Camkkβ表达降低,Bcl-2表达上调、Bax表达下调(P＜0.05).结论 硫化氢可通过降低神经元海马Camkkβ蛋白表达、上调Bcl-2蛋白表达、抑制Bax蛋白表达来减轻短暂脑缺血/再灌注损伤.
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CaMKKβ通过激活AMPK/JAK2/STAT3信号促进小鼠单核巨噬细胞向M2表型转换
目的·探明钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β (CaMKKβ)在白介素4(IL-4)诱导的RAW264.7细胞极化过程中的作用和机制.方法·RT-PCR和ELISA检测IL-4诱导RAW264.7细胞极化水平,Western blotting测定极化过程中CaMKKβ、AMPK、JAK2、STAT3蛋白表达及磷酸化水平.慢病毒为载体的shRNA稳定干扰RAW264.7细胞CaMKβ表达,RT-PCR和ELISA检测IL-4诱导下细胞极化水平的改变,Western blotting检测AMPK、JAK2、STAT3蛋白及磷酸化蛋白的表达.分别特异性阻断AMPK、JAK2和STAT3蛋白活性,经RT-PCR检溯IL-4诱导下RAW264.7细胞极化水平的改变.结果·IL-4主要诱导RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞极化(P＜0.05),且CaMKKβ、AMPK、JAK2、STAT3的磷酸化水平明显升高(均P＜0.05).shRNA稳定干扰RAW264.7细胞CaMKKβ表达后,IL-4促进巨噬细胞向M2型极化作用降低(P＜0.05),且AMPK、JAK2和STAT3的磷酸化水平降低(均P＜0.05).分别阻断AMPK、JAK2和STAT3,巨噬细胞向M2型极化减少(均P＜0.05).结论·CaMKKβ通过激活AMPK/JAK2/STAT3信号通路,促进IL-4诱导的巨噬细胞M2型极化.
