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阳离子脂法介导质粒转染大鼠骨髓基质干细胞用于基因修饰的细胞移植治疗
目的探讨阳离子脂转染方法在骨髓基质干细胞(BMSC)基因转染中的应用.方法通过梯度试验确定相对佳的转染条件并测定LipofectamineTM2000(LP2000)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率;分析细胞周期对导入基因表达的影响;以流式细胞仪测定转基因BMSC的EGFP表达强度和阳性比例随时间的变化;将EGFP基因转染的大鼠BMSC注射法移植入同源大鼠心肌内,以逆转录PCR法检测心肌组织内EGFP基因的转录,荧光显微镜法检测EGFP阳性的BMSC.结果在不同转染条件下(DNA浓度、DNA:LP2000),LP2000介导EGFP基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率不同;通过阳离子脂法导入基因的表达效果受细胞周期制约;细胞移植后,能在大鼠心肌组织中检测到EGFP基因的转录以及表达EGFP基因的BMSC.结论阳离子脂可以作为基因修饰的细胞移植治疗的有效载体.为了提高基因转染的瞬时效率和基因的表达效率,降低毒性、满足转基因细胞移植的要求,尚需进一步的研究.
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软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤
目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况.方法 BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽.将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察.将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C3组,每组15只,并于股骨髁处造模.分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组).于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析.结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长.A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组.软骨组织学评分A组优于B、C组(P＜0.05).结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好.
关键词： PLGA-Ⅱ型胶原支架 骨髓基质于细胞 骨软骨损伤 -
人骨髓基质干细胞体外诱导为成骨细胞的实验研究
目的:探讨体外培养的人骨髓基质干细胞(hBMSCs)诱导分化为成骨细胞的方法.方法:抽取骨髓,用梯度离心法分离单个核细胞,用含10%胎牛血清的DMEM普通培养基培养,传代后改用含β-甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松的条件培养基培养,用相差显微镜下观察细胞形态,钙钴法碱性磷酸酶染色,Von Kossa法钙结节染色及细胞内ALP含量测定.结果:形态学观察、碱性磷酸酶染色、钙结节染色及细胞内ALP含量测定均表明,hBMSCs经条件培养基培养后诱导的细胞具有成骨细胞的形态学及生物学特性.结论:hBMSCs体外经含β-甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松的条件培养基培养可诱导为成骨细胞.
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骨髓基质干细胞移植与脊髓损伤
目前,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的治疗仍然是骨科领域中一个极具挑战性的课题.传统观点认为脊髓损伤是不可修复和再生的.现在认为神经元和神经胶质的丧失是脊髓损伤后神经功能永久性障碍的主要原因[1].由于中枢神经系统的自我修复能力有限,神经元和神经胶质无法再生修复.近年来,随着神经生物学研究和组织工程学的迅速发展,人们对神经干细胞和骨髓基质于细胞(marrow stromalcells,MSCs)研究逐渐深入,通过干细胞移植替代缺失的神经细胞有望成为治疗脊髓损伤的有效办法.
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聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究
目的 评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性.方法 原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL/cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1/16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量,BCA法测定蛋白质含量.结果 第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75.6%,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异.结论 PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性.
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骨髓基质干细胞成骨的研究进展
组织工程学是生命科学中新兴学科,是生物医学工程领域的一个快速发展的新方向.骨组织工程学是骨外科学主要发展方向之一.骨髓基质干细胞有明确的成骨作用,其特点为来源丰富、提取方便、体外扩增迅速、易于成骨诱导、可导入标记性或治疗性基因,因此认为骨髓基质干细胞是骨组织工程学中理想的种子细胞.本文就骨髓基质干细胞成骨进展作一综述.
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SPIO标记大鼠骨髓基质干细胞及体外磁共振成像研究
目的 探讨以多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)为转染介质介导超顺磁性氧化铁微粒(superparamgnetic ironoxides,SPIO)标记大鼠骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的合适条件,通过标记细胞的体外磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)获取佳的磁共振扫描序列.方法 分离、纯化、培养大鼠BMSCs,SPIO和PLL以1:0.001 2混合配制氧化铁一多聚赖氨酸(F-PLL)混合液,用铁浓度分别为0、4.2、8.4、21、42、84μg/ml的FE-PLL复合物标记BMSCs.计算细胞标记阳性率,测量并绘制末标记细胞和不nd浓度铁标记细胞的MTT生长曲线;对不同浓度铁标记的细胞进行磁共振成像.分别用浓度为0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0 μg/ml的PLL同BMSCs共同培养,了解各种浓度PLL对细胞的生存是否有影响.结果 细胞的标记率分别为O%、(44.40±11.33)%、(71.97 4±8.01)%、(88.86±9.10)%、(98.24±2.94)%、100%,随着SPIO浓度的增加而增加.MTT显示在铁浓度＜42 μg/ml时FE-PLL上复合物对细胞的生长活性无明显影响,而铁浓度为84μg/ml时,细胞的生长活性受到抑制.PLL在浓度≤1.0μg/ml时对细胞的活力无明显影响;当PLL浓度为5.0μg/ml时,细胞生长明显受抑.MRI信号随FE-PLL复合物浓度的增加而增加(P＜0.05),标记细胞的信号在T1WI的改变不及在T2WI及T2*WI明显,而以T2*WI信号改变明显(P＜0.05).结论 以PLL为转染介质,SPIO能够高效的标记BMSCs,并且在合适的浓度范围内不会影响干细胞的生长活性.
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去抗原异种松质骨与骨髓基质干细胞相容性研究
目的:了解去抗原异种松质骨(AEXCB)对骨髓基质干细胞增殖的影响,为细胞移植载体的选择提供依据.方法:取新生小牛股骨下端松质骨经物理化学处理,制成去抗原异种松质骨载体,与兔骨髓基质干细胞(BMSC)体外复合培养,通过扫描电镜、MTT测试法、考马斯亮蓝和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法,观察去抗原异种松质骨材料对细胞生长、增殖及功能表达的影响.结果:骨髓基质干细胞能在AEXCB材料上粘附、增殖,细胞形态良好.去抗原异种松质骨与BMSC作用后ALP活性的吸光收(0D)值,与对照组比较无显著差异.结论:去抗原异种松质骨材料无细胞毒性作用,具有良好的细胞相容性.可用作骨组织工程的支架材料.
