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Kinectin研究进展
KNT(kinectin)是内质网膜上的一种膜受体蛋白,完整的人KIN的相对分子质量为156×103,基因定位于14号染色体q22.1上,cDNA全长4.6 kb,含有编码1364个氨基酸的开放阅读框架.KNT除主要作为kinesin的受体参与细胞内囊泡转运外,还可以通过锚定延长因子1复合物到内质网上来调节真核细胞内蛋白的合成,可调节内质网活性膜扩张,参与了胰岛壁细胞中微管依赖激素的分泌过程,可抑制吞噬体沿微管双向运动.KNT与疾病存在相关性,如白塞病、肝细胞癌、再生障碍性贫血等.
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白塞病相关自身抗原Kinectin的表达型cDNA文库筛选与鉴定
目的研究白塞病患者血循环中的自身抗体及其针对的细胞内靶抗原.方法应用免疫印迹-化学发光法对39例白塞病患者血清进行初步研究,以含有高滴度抗体的患者血清作为"探针"免疫筛选表达型λZAP噬菌体cDNA文库并鉴定候选克隆,通过真核转录、翻译以及免疫沉淀实验分析阳性克隆表达产物的抗原性.结果文库筛选获得6个独立候选克隆,均为人Kinectin部分全长cDNA,以其中大克隆的基因表达产物为抗原基质的免疫沉淀研究显示,23.1%(9/39)的白塞病患者血清呈阳性反应,正常人以及系统性红斑狼疮、干燥综合征患者对照阴性.结论Kinectin是白塞病相关自身靶抗原;抗Kinectin抗体与白塞病免疫发病机制的关系值得深入探索,抗体可能对疾病具有潜在血清学诊断价值.
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抗Kinectin抗体与白塞病相关性研究
目的研究抗kinectin抗体与白塞病的关系.方法从人喉癌上皮细胞(Hep2细胞)抽提RNA,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增碱基序列相当于kinectin的氨基酸503～994(kin-m)和氨基酸920～1 346(kin-3) 两个片段,并克隆到pET42-a(+)载体中.诱导表达的融合蛋白经纯化后建立酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并对白塞病患者血清进行分析.结果构建的表达kinectin载体能在大肠杆菌中表达具有抗原性的肽段,用纯化的融合蛋白建立检测抗kinectin抗体的ELISA方法,对46例白塞病患者、118例其他自身免疫病患者及51名正常人检测显示kinectin抗体阳性率分别为白塞病63%(29/46),系统性红斑狼疮22%(8/37)、类风湿关节炎16%(5/31)、干燥综合征41%(11/27)、混合性结缔组织病29%(4/14).与118例其他自身免疫病相比,白塞病中抗kinectin抗体的检出率明显升高(P＜0.01).结论 Kinectin是白塞病的相关抗原,在其他自身免疫病中也可检测到该抗原抗体,其意义有待进一步研究.
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白塞氏病相关抗原的重组表达及抗原性初步分析
目的:探讨Kinectin的抗原性,为下一步研究Kinectin在白塞氏病中的意义奠定基础.方法:从人Hep2细胞抽提RNA,利用RT-PCR扩增能覆盖Kinectin全长的3个片段,其位置分别相当于氨基酸22～510(kin-5),503～994(kin-M)和920～1 346(kin-3).将扩增的PCR片段克隆到pET42-a(+)载体中,诱导表达的融合蛋白用白塞氏病病人血清进行Western blot分析.结果:构建的3个表达Kinectin部分片段载体(pET/kin-5、pET/kin-M和pET/Kin-3)具有正确的阅读框架,DNA测序符合率为99%,能在大肠杆菌中表达相应的肽段.8份阳性血清中,用Western blot分析发现,6份血清与kin-M反应,5份血清与kin-3反应,只有一份血清与kin-5有反应.结论:成功地构建表达覆盖Kinectin全长的3个载体,并初步发现Kinectin的抗原性可能主要位于其中间段和羧基端.
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再生障碍性贫血免疫损伤机制及相关淋巴细胞的研究
再生障碍性贫血的发病机制还未完全明确,其研究进展不断有所报道.随着对其发病机制研究的不断深入和对临床经验的不断总结,除外T淋巴细胞免疫功能紊乱,B细胞介导的体液免疫紊乱和再生障碍性贫血的关系也逐渐受到重视,特别是和再障相关的体液因子.现在就这方面作一综述,希望能为实验研究及临床治疗提供更多的思路.
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肝癌相关抗原kinectin基因片断的重组表达
目的:研究肝癌相关抗原kinectin基因片断的体外重组表达方法,为该抗原的生产奠定基础.方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原kinectin的基因片断,将目的基因插入表达载体pMAL-C2上麦芽糖结合蛋白(MBP)基因下游的多克隆位点,转化DH5α菌.通过蓝白斑筛选、PCR鉴定、内切酶鉴定及DNA测序筛出正确的重组子,并用其转化TB1菌.用IPTG对重组的TB1工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定.结果:kinectin基因片断正确插入pMAL-C2载体的多克隆位点,用IPTG对工程菌进行诱导,可见目的蛋白条带出现.结论:pMAL-C2载体可用于对肝癌相关抗原kinectin的体外基因重组表达.
