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肿瘤源性外切体负载的间充质干细胞抗肿瘤活性的实验研究
目的:分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体及同基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);将外切体负载经γ干扰素(IFN-γ)刺激活化的间允质干细胞,探讨其抗肝癌细胞活性改变.方法:利用超滤及密度梯度离心法分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体;利用贴壁培养联合免疫磁珠阴性分选法体外培养同基因小鼠骨髓间充质干细胞;外切体负载活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育,72 h后观察H22细胞增殖状态.结果:外切体负载的IFN-γ刺激活化的间允质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育72 h后,活化组H22细胞增殖速度明显低于对照组.结论:负载肿瘤源性外切体的间充质干细胞抗肝癌细胞活性明显增强,间充质干细胞联合肿瘤源性外切体有可能成为一种更为有效的外切体疫苗诱导抗肿瘤效应.
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大鼠骨髓间质干细胞来源的外切体抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡
目的：观察大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）来源的外切体（exosome）对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法：原代培养大鼠骨髓 MSC 并提取外切体鉴定。构建顺铂损伤 NRK-52E 细胞模型，损伤组为5μmol／L 顺铂处理6 h 后正常营养液培养48 h，处理组为顺铂损伤后以100μg／mL 外切体共培养48 h。未经任何处理的 NRK-52E 细胞为对照组。TUNEL-FITC，凋亡双染流式细胞术，蛋白质免疫印迹技术检测各组细胞凋亡情况。结果：与对照组比较，损伤组 NRK-52E 细胞肿大，胞核不规则样改变，凋亡细胞增多，凋亡相关蛋白 Bax 上调而Bcl-2下调；处理组 NRK-52E 细胞肿大较损伤组缓解，胞核形态改善，凋亡细胞减少，Bax 下调且 Bcl-2上调。结论：大鼠骨髓 MSC 来源的外切体对顺铂诱导的 NRK-52E 细胞凋亡有一定的抑制作用。
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脐带间质干细胞来源的外切体对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞损伤的修复作用
目的:研究人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSC-Ex)对顺铂诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的修复作用,并探讨可能的作用机制.方法:体外建立顺铂诱导的HK-2细胞损伤模型,实验组以16 μmol/L浓度的顺铂作用HK-2细胞16 h,再加入hucMSC-Ex共培养,同时选择人肺成纤维细胞的外切体(HFL1-Ex)为对照,8h后采用蛋白质印迹法和FITC-Tunel技术检测hucMSC-Ex对损伤HK-2细胞的抗凋亡和促增殖情况.未经任何处理的HK-2细胞作为正常对照组,单纯顺铂损伤并加等量PBS为PBS对照组.结果:成功建立了顺铂诱导的HK-2细胞损伤体外模型,蛋白质印迹分析显示hucMSC-Ex处理改善了顺铂对HK-2细胞的损伤,凋亡蛋白Bax表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达相应升高.FITC-Tunel检测也显示HK-2细胞的凋亡明显减弱.而MTT分析显示hucMSC-Ex处理后,HK-2细胞的增殖能力显著增强.结论:HucMSC-Ex对顺铂诱导的HK-2细胞损伤有一定的修复效果,可能是通过促进HK-2细胞的增殖和抑制其凋亡来实现的.
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人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用
目的:研究人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSC-exosome)对大鼠缺血/再灌注(I/R)损伤心肌细胞的修复作用.方法:在体内,建立大鼠I/R模型:经冠状动脉左前降支(LAD)结扎缺血30 min后取消结扎恢复灌注,与此同时,尾静脉注射hucMSC-exosome.在体外,建立大鼠H9C2(2-1)心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型:细胞于无血清低糖培养基中缺氧(5% CO2/93% N2)24 h后,用含hucMSC-exosome的高糖10% FBS培养液复氧24 h.采用MTT法、TUNEL法、心肌酶谱以及线粒体膜电位等方法检测大鼠心肌细胞的增殖和凋亡状况.结果:在体内,心肌细胞经I/R损伤后,hucMSC-exosome与hucMSC处理组较PBS处理组血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)值均下降;TUNEL结果显示,前两组较PBS处理组心肌细胞凋亡明显减少;在体外,心肌细胞经H/R损伤后,MTT实验表明细胞增殖显著减弱,hucMSC-exosome作用后,TUNEL及线粒体膜电位(ΔΨm)结果分别显示受损心肌细胞凋亡以及膜电位下降明显减少.结论:hucMSC-exosome能有效抵抗心肌细胞因缺血/再灌注损伤而引起的细胞凋亡.
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人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠肾小管上皮细胞缺氧损伤的干预作用
目的:观察体外缺氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡情况以及分离纯化人脐带间质干细胞来源的外切体( hucMSCs-exosomes)对其干预作用.方法:将体外培养的NRK-52E细胞随机分为对照组、缺氧损伤模型组和hucMSCs-exosomes (0.5,1.0 mg/ml)预处理组.随后进行细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期以及凋亡率的变化.结果:与对照组相比,模型组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P＜0.01),Bcl-2/bax表达下调(P＜0.01),细胞周期S期阻滞以及凋亡细胞比例明显增多.而hucMSCs-exosomes预处理组可明显改善缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,改善细胞周期和凋亡细胞的比例(P均＜0.05).结论:NRK-52E在缺氧损伤时有明显的细胞凋亡,而hucMSCs-exosomes预处理可能通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤.本实验可为进一步研究hucMSCs-exosomes在组织损伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础.
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MCSCs-exosomes对成年大鼠心肌细胞缺氧损伤的干预作用
目的 探讨来源于骨髓源性心肌干细胞的外切体(MCSCs-exosomes)对成年大鼠心肌细胞体外缺氧损伤诱导凋亡的干预作用.方法 将体外培养的成年大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧组和MCSCs-exosomes预处理组.随后进行形态学观察、细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测凋亡率的变化.结果 与对照组相比,缺氧组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P＜0.01),Bcl-2/bax表达下调(P＜0.01),凋亡细胞比例明显增多.而MCSCs-exosomes预处理组可明显改善缺血缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,降低凋亡细胞的比例(P均＜ 0.05).结论 MCSCs-exosomes预处理可以明显改善体外培养缺氧损伤诱导的成年大鼠心肌细胞的凋亡情况,其机制可能是通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤.
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干细胞外切体对大鼠心肌缺血再灌注损伤及Akt/GSK-3β通路的影响
目的 探讨骨髓源性心肌干细胞来源的外切体对大鼠心肌缺血再灌注损伤及Akt/GSK-3β通路的影响.方法 64只SD大鼠随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、外切体干预组(Ex组)、外切体干预联合PI3K抑制剂组(Ex+L组).再灌注后2h各组取8只大鼠,ELISA法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,Westernblot测定检测心肌组织Akt和P-GSK-3β水平;其余8只大鼠存活4周后用Masson染色检测心肌组织中胶原纤维.结果 与I/R组相比,Ex组血清CK-MB、LDH水平降低,心肌胶原纤维减少,心肌Akt和P-GSK-3β水平增加(均P＜0.01).结论 骨髓源性心肌干细胞来源的外切体可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,这种保护作用可能与Akt/GSK-3β信号通路激活有关.
关键词： 骨髓源性心肌干细胞 外切体 缺血再灌注损伤 Akt/GSK-3β通路 -
羊水中外切体的鉴定与其RNA浓度测定
[目的]分离鉴定羊水中的外切体,并测定羊水外切体中RNA的浓度,探讨从羊水外切体中提取RNA的可行性,从而进一步为胎儿肾脏疾病产前诊断和胎儿肾功能监测寻找生物指标提供研究基础.[方法]对8例妊娠22～30周并有产前诊断指征的孕妇分别采用常规羊膜腔穿刺术收集到羊水10 mL进行检测分析,通过多步离心法及蔗糖密度梯度离心法提取羊水中的外切体,采用透射电镜、流式细胞术及激光共聚焦对其进行鉴定,trizol法对分离到的外切体进行RNA提取,紫外分光光度计测定其RNA浓度.[结果]透射电镜结果示微囊小体形态均一、大小相近,直径范围40～100 nm,呈外切体典型的杯状结构,由脂质双层膜包裹的扁平球体,其外周及内含物均可见负染效应；流式细胞仪上可见CD24阳性率为(92.23±3.8)％；共聚焦显微镜下进行检测,于胶珠表面可见到荧光带；紫外分光光度计测得的RNA浓度分别为28.67、30.02、37.57、21.08、49.41、24.57、24.24、26.77 ng/μL,平均浓度为30.29 ng/μL.[结论]羊水中含有外切体,且其表面CD24分子阳性,说明其来源于胎儿肾脏.羊水中外切体含有RNA,由羊水中分离外切体并提取RNA可为进一步对胎儿肾脏疾病的产前诊断和胎儿肾功能的监测寻找生物指标提供基础材料.
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离心过滤法提取外切体的实验研究
目的:利用外切体的物理特性,用基于孔径分离的生物膜离心过滤法制备外切体,以降低其研究及应用的技术门槛. 方法:以树突状细胞的培养上清作为外切体的来源,分别用传统的超高速密度梯度离心法和生物膜离心过滤法制备外切体,再利用透射电镜进行两者之间形态学鉴定,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质成分的鉴定. 结果:两种方法的提取物在超微结构及形态方面非常相像,其蛋白质谱几乎一致. 结论:基于生物膜分离技术的离心过滤法可制备出外切体.
