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水通道蛋白9磷酸化对哺乳动物细胞中砷摄入的影响
目的 研究水通道蛋白9 (AQP9) mRNA表达水平、水通道蛋白9及p38蛋白表达及其磷酸化水平对肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L-02砷摄入的影响,探讨水通道蛋白9磷酸化的调控机制.方法 采用电感藕合等离子体质谱法(ICP-MS)测定细胞内砷含量.采用实时定量PCR、免疫印迹法和免疫共沉淀技术分别检测不同处理后两细胞株中水通道蛋白9 mRNA、水通道蛋白9和p38蛋白表达水平及其磷酸化水平.采用SPSS统计软件分析实验数据.结果 HepG2细胞内砷含量及摄入速度高于L-02细胞.HepG2细胞的水通道蛋白9 mRNA表达水平在6h内随NaAsO2处理时间延长而显著增加(P＜0.05),而在L-02细胞无明显变化.在2h时,HepG2细胞水通道蛋白9基因表达水平在各NaAsO2处理浓度均显著增加(P＜0.05).免疫沉淀实验结果显示,HepG2细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化水平随NaAsO2处理时间和浓度的增加而增加,而L-02细胞在各时间和浓度处理点水通道蛋白9蛋白磷酸化水平与对照相比明显增加,但处理间无明显差异；p38的磷酸化水平在两种细胞中均随砷处理时间延长而增加；SB203580抑制p38活性后能完全取消L-02细胞水通道蛋白9蛋白的磷酸化,而对HepG2细胞水通道蛋白9蛋白磷酸化无明显影响.结论 水通道蛋白9的表达及磷酸化水平可能在调节细胞砷摄入中发挥重要作用,在不同细胞中水通道蛋白9蛋白磷酸化的调控机制有所差异.
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长时间低浓度暴露亚砷酸钠促进人正常膀胱上皮细胞增殖
以不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)(0、0.1、0.5、1.0 μmol/L)对人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)进行长期染毒,采用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测细胞活力.未经砷染毒的SV-HUC-1进行长期传代培养,细胞增殖活力没有发生任何改变;0.1、0.5 μmol/L NaAsO2处理20代后,细胞增殖活性显著增高,并呈剂量-反应增高趋势(r=0.632、P＜0.01,r=0.939、P＜0.01),而1.0 μmol/L NaAsO2处理的细胞其增殖活力未随染毒时间而发生变化(P＞0.05).提示长时间低浓度暴露NaAsO2可以促进SV-HUC-1增殖.
关键词： NaAsO2 SV-HUC-1细胞 增殖 -
Morris水迷宫法探讨化风丹对大鼠空间记忆能力的影响
目的:比较万胜化风丹、廖元和堂化风丹、氯化汞(HgCl2)和亚砷酸钠(NaAsO2)对健康SD大鼠空间记忆能力的影响.方法:清洁级SD大鼠每天分别喂食万胜化风丹(420mg·kg-1,含汞10.9mg·kg1,含砷8.8mg·kg-1)、廖元和堂化风丹(420mg· kg1,含汞10.9mg· kg-1,含砷8.8mg·kg1)、HgCl\-2(5mg· kg-1,合汞3.7g·kg-1)、NaAsO\-2(5mg·kg1,含砷2.9mg·kg-1)以及空白对照组,持续60天,使用Morris水迷宫(MWM)法检测其空间学习能力.结果:用药前大鼠潜伏期在第1～4天无明显变化,训练第5天各组潜伏期显著下降;用药后训练第1～5天各组潜伏期呈明显下降趋势.与正常组比较,用药前各组在第1～5天均无显著差异,用药后HgCl2组在第2～5天均有显著性差异(P＜0.05),万胜化风丹组、廖元和堂化风丹组及去NaAsO2组仅在第4天差异显著(P＜0.05);与HgCl2组比较,用药前各组在第1～5天均无显著差异,用药后万胜化风丹组、廖元和堂化风丹组和NaAsO2组在第2～5天均差异显著(P＜0.05).结论:HgCl2长期应用可显著降低大鼠中枢神经系统的空间记忆能力,化风丹对此无明显影响.
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化风丹对大鼠的亚慢性肝肾毒性研究
目的:比较古方化风丹、万胜化风丹、廖元和堂化风丹、去朱砂雄黄化风丹以及氯化汞(HgC12)、亚砷酸钠(NaAsO2)对大鼠肝肾组织的亚慢性毒性作用.方法:清洁级SD大鼠每天分别灌胃古方化风丹(420mg·kg1,含朱砂10％、雄黄10％)、万胜化风丹(420mg· kg1,含朱砂3％、雄黄3％)、廖元和堂化风丹(420mg·kg1,含朱砂3％、雄黄3％)、去朱砂雄黄化风丹(420mg·kg1,含朱砂0％、雄黄0％)、HgC12(5mg·kg1)和NaAsO2(25mg·kg1),连续喂食60天,并设正常对照组,观察大鼠一般情况及体重,于末次给药后断头取血、肝脏及肾脏,计算肝脏指数和肾脏指数,检测大鼠血清谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、尿素氮、肌酐含量,检测肝、肾组织中汞砷蓄积量,RT-PCR法检测肾蛋白激酶1(Kim-1)、金属硫蛋白-1(MT-1)、基质金属蛋白酶7(MMP7)、肝组织金属硫蛋白-2(MT-2)、蛋白激酶1(Kim-1)及细胞色素P450酶(CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1)水平变化.结果:氯化汞组、亚砷酸钠组大鼠在各时间段体重增长均显著低于正常组(P＜0.05),古方化风丹组大鼠在60d时体重低于正常(P＜0.05),其他化风丹各组大鼠体重、一般情况与正常组比较均无明显差异;与正常组比较,氯化汞组大鼠血清谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、尿素氮、肌酐含量以及肝肾指数均明显增高(P＜0.05),亚砷酸钠组亦有不同程度的升高,化风丹各组则与正常组无明显差异;氯化汞组(亚砷酸钠组)在大鼠肝肾组织的汞(砷)蓄积量明显升高(P＜0.05),含朱砂(雄黄)的各组化风丹在肝肾组织的汞(砷)蓄积量仅为其1/5～1/10,且古方化风丹与现代方化风丹在肝肾组织的汞(砷)蓄积量与其所含朱砂(雄黄)的含量无明显倍数关系;氯化汞组及亚砷酸钠组对大鼠肝脏Kim-1、MT-2 mRNA相对表达量均有显著的升高,且氯化汞组显著高于亚砷酸钠组(P＜0.05).古方化风丹组及万胜化风丹组可轻度诱导大鼠肝脏MT-2 mRNA的相对表达,但化风丹各组方对大鼠肝脏Kim-1 mRNA相对表达量无明显诱导作用.化风丹各组方可显著增加肝脏CYP2B1 mRNA的相对表达量(P＜0.05),而对肝脏CYP2E1、CYP2A1 mRNA的相对表达量呈不同程度的抑制作用,且对CYP3A1 mRNA相对表达量抑制作用较为显著(P＜0.05).氯化汞组及亚砷酸钠组对CYP2B1 mRNA的相对表达量无明显影响,对CYP2E1 mRNA的相对表达量有显著的增加作用(P＜0.05).而氯化汞组对CYP2A1 mRNA的相对表达量有显著的增加作用(P＜0.05).同时,与正常组比较,氯化汞组及亚砷酸钠组对大鼠肾Kim-1、MT-1和MMP-7 mRNA相对表达量均呈显著的诱导作用(P＜0.05).化风丹各组方(除外去朱砂雄黄组)对MT-1 mRNA相对表达量亦有轻度诱导作用.病理学检查显示,正常组及化风丹各组肝组织中存在较多的脂肪空泡,未见其他显著的病理损伤,化风丹各组肾组织病理切片与正常组比较无明显差异,而氯化汞及亚砷酸钠两组镜下可见较多的肝肾损伤表现,且氯化汞组相对较重.结论:给予大鼠化风丹60d并未引发机体肝肾组织的明显毒性反应,通过减少化风丹中朱砂、雄黄含量来降低化风丹毒性无确切依据.
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NaAsO2对人淋巴细胞染色体畸变、姊妹染色单体互换的影响
目的分析人淋巴细胞遗传物质在NaAsO2作用下受到损伤的情况,进一步探讨砷对人体细胞遗传物质损伤的作用机理.方法用不同浓度的NaAsO2(2.01×10-6 m ol/L、4. 13×10-6 mol/L、6.24×10-6 mol/L)对在体外培养的人淋巴细胞进行染毒, 对淋巴细胞出现的染色体畸变率、姊妹染色单体互换率进行分析.结果不同浓度NaAsO2处理的淋巴细胞,出现的染色体畸变率(8%、10.5%、15%)、姊妹染色单体互换率(11%、15%、21%)显著高于对照组(2.5%、2%). 结论 NaAsO2直接作用人淋巴细胞的染色体,是人淋巴细胞遗传物质的毒性因子.
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亚砷酸钠对L-02肝细胞的氧化损伤作用
[目的]探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对体外培养的人肝细胞株(L-02)的氧化损伤作用. [方法]用不同浓度NaAsO2(50,100,150 μmol/L)染毒L-02肝细胞24 h,MTT法检测NaAsO2对L-02肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测L-02肝细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;钼酸铵法测定过氧化氢酶(catalase,CAT)活性;单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)法检测DNA损伤. [结果]NaAsO2作用L-02肝细胞24h后,50、100、150 μmol/L浓度NaAsO2组的L-02肝细胞存活率和CAT活性与对照组相比显著降低(P<0.01).且呈剂量-反应关系;100、150μmol/L浓度NaAsO2组ROS生成量显著增多(P<0.01);50 μmol/L的NaAsO2即可引起出现彗星现象的细胞数明显高于对照组,拖尾细胞阳性率明显升高(P<0.01),且呈剂量-反应关系. [结论]NaAsO2对L-02肝细胞的生长具有明显的抑制作用,可引起L-02肝细胞内ROS增多和CAT活性降低,引起细胞DNA损伤.
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JNK信号通路在NaAsO2诱导L-02肝细胞凋亡过程中的作用
目的 研究JNK在NaAsO2诱导L-02肝细胞凋亡中的作用.方法 用不同浓度NaAsO2染毒L-02肝细胞,采用流式细胞术检测L-02肝细胞凋亡率;Western-blot检测L-02肝细胞中Jnk、p-Jnk、Caspase-3蛋白的相对表达量.结果 0、50、100和150 μmol/L组细胞凋亡率分别为3.33％±0.30％、7.49％±0.23％、9.48％±0.49％和14.87％±2.17％,染毒组的细胞凋亡率随NaAsO2浓度的增加而升高,差异有统计学意义(P＜0.05);染毒组细胞内Jnk、p-Jnk、Caspase-3蛋白相对表达量均增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NaAsO2能诱导L-02肝细胞凋亡的发生,这可能与激活JNK,增加JNK磷酸化水平,继而激活凋亡调控基因Caspase-3有关.
