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RNAi下调PIK3 CB表达抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究
目的 探讨应用RNAi技术靶向磷酸肌醇酯-3-激酶β催化亚单位(PIK3CB)抑制恶性胶质瘤细胞系U251的PIK3CB表达后在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法 将短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-PIK3CB进行脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达,检测细胞转染前后的细胞增殖能力和凋亡的变化.应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用,对肿瘤组织应用免疫荧光双染色和免疫组化的方法分析结果.结果 靶向PIK3CB的shRNA转染后U251细胞生长受到抑制,细胞周期出现G2/M阻滞,细胞明显凋亡.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-PIK3CB显著抑制皮下肿瘤生长(P＜0.01).结论 靶向PIK3CB的shRNA基因治疗可以成为胶质瘤治疗的新策略.
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UbcH10基因沉默对裸鼠移植性大肠癌抑制作用
目的 通过短发夹RNA (shRNA)干扰沉默UbcH10基因的表达,并观察其对裸鼠移植结直肠癌的抑制作用.方法 构建RNA干扰表达载体pGPU6/GFP/Neo/UbcH 10 -RNAi(pUbcH10 - RNAi),建立UbcH10基因沉默细胞系HT-29/UbcH10-RNAi;采用蛋白印迹法(western blot)评价pUbcH10-RNAi对UbcH10基因表达的影响,观察移植结直肠癌裸鼠的肿瘤生长情况.结果 HT-29/UbcH10-RNAi细胞中UbcH10基因表达明显下调；与对照组比较HT-29/UbcH10-RNAi组肿瘤生长明显减慢,在接种肿瘤细胞12 d后隐约可见瘤体,36 d后断颈处死剥离瘤体重量仅是对照组肿瘤的40％左右.结论 短发夹RNA (shRNA)沉默UbcH10基因对裸鼠移植性大肠癌有抑制作用,提示抑制UbcH10基因表达可能是大肠癌治疗的潜在方法.
关键词： 大肠癌 泛素结合酶UbcH10 短发夹RNA(shRNA) 裸鼠移植瘤 -
EPCR基因mRNA在人胃癌细胞系中的表达及其shRNA干扰载体内源性筛靶研究
目的 检测人胃癌细胞株中内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein creceptor,EPCR)基因的mRNA表达水平,构建EPCR基因特异的短发夹RNA(shRNA)干扰载体,并通过内源性筛靶实验检测EPCR mRNA表达,筛选出佳的干扰靶序列.方法 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Westernblot)检测胃癌细胞系(SGC7901、MGC803、HGC27、AGS)中EPCR mRNA和蛋白的表达,筛选出EPCR高表达的细胞株;设计5对EPCR基因特异性短发夹RNA(shRNA)干扰片段pGPH1/GFP/Neo-EPCR,用Lipofec-tamine 2000将pGPH1/GFP/Neo-EPCR转染入EPCR高表达的人胃癌细胞,以pGPH1/GFP/Neo空载体作对照;转染后通过观察绿色荧光蛋白来判断转染的效率,选出优质粒/脂质体比;转染后收集样本,采用RT-PCR及Western blot进行检测,筛选出有效的干扰片段.结果 EPCR在MGC803细胞中表达量高;佳质粒:脂质体比值为1μg:1μL;pGPH 1/GFP/Neo-EPCR-homo-555为有效的干扰质粒.结论 成功筛选出针对EPCR基因特异的shRNA干扰载体,转染细胞后可下调EPCR的表达,为进一步研究EPCR的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础.
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沉默组织因子重组腺病毒的构建和胰岛中沉默效果检测
目的 构建复制缺陷型重组腺病毒介导短发夹RNA(shRNA):干扰组织因子(TF)在胰岛表达.方法 设计并合成四对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导入成人胰岛,通过实时定量RT-PCR方法筛选对TF沉默效果佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组.筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达TF-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒并测定其病毒滴度.通过实时定量RT-PCR腺病毒沉默TF效果予以检测.结果 测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从四对ds oligos筛选出对组织因子沉默效果佳的穿梭质粒pENIR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-TF复制缺陷型重组腺病毒.转染胰岛后,通过实时定量RT-PCR方法检测发现shRNA-TF腺病毒感染胰岛后对TF mRNA的沉默效果4 d后达佳效果,为54.29%(P＜0.05 vs NC).结论 成功构建的介导shRNA复制缺陷型重组腺病毒可以体外抑制胰岛细胞中组织因子的表达.
关键词： 重组腺病毒 组织因子 短发夹RNA(shRNA) 胰岛 基因沉默 -
大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定
目的 在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果佳者进行慢病毒包装并鉴定.方法 将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量.对于筛选所得干扰效果佳的质粒,采用pPACKH1 TM慢病毒载体系统进行病毒包装.利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测.结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果佳.成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功.转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞.结论 成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础.
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应用shRNA技术研究NDRG2在人胃癌细胞SGC7901增殖中的作用
目的:构建针对人N-myc下游调节基因2(NDRG2)的短发夹RNA(shRNA)表达载体pSNAV-shRNA,观察其在SGC7901细胞中对NDRG2的抑制作用以及NDRG2被抑制后细胞增殖能力的变化.方法:PCR扩增针对NDRG2的shRNA表达框架,构建pSNAV-shRNA质粒,转染SGC7901细胞,通过RT-PCR,免疫印迹试验检测其对NDRG2表达的影响;通过细胞周期分析,软琼脂集落形成试验检测细胞增殖能力的变化.结果:将构建好的pSNAV-shRNA质粒转染SGC7901细胞后,NDRG2的表达受到明显的抑制,细胞周期G1期阻滞,集落形成能力降低.结论:构建的pSNAV-shRNA质粒能够有效抑制NDRG2在SGC7901细胞中的表达,降低SGC7901细胞的增殖能力.
