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过表达钙整合素结合蛋白CIB诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡的实验研究
目的 观察CIB基因对人胶质瘤SHG44细胞体外生长和细胞凋亡的影响.方法 构建重组质粒pcDNA3-CIB,转染人胶质瘤细胞株SHG44,MTT观察各组细胞的体外生长情况,流式细胞术(FCM)测定各组细胞的细胞周期和凋亡细胞数量,Western-blot检测CIB转染后凋亡相关蛋白的表达变化.结果 RT-PCR、Western印迹显示pcDNA3-CIB转染组CIB的mRNA及CIB蛋白表达水平明显高于对照组;与对照组细胞相比,转染CIB的SHG44-CIB组细胞牛长明显减缓(P＜0.01),SHG44-CIB组细胞G_1、S期细胞减少,G_2期细胞增多,凋亡细胞增加至19.2%;凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调,Bax表达上调.结论 CIB在体外明显抑制SHG44细胞的生长并诱导其发生凋亡,CIB诱导的凋亡可能与Bcl-2及Bax表达的变化相关.
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钙整合素结合蛋白CIB真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达
目的 构建钙整合素结合蛋白(calcium- and integrin-binding protein, CIB)的真核表达载体,了解它在真核细胞中的表达及定位.方法 从人脑组织分离总RNA,采用RT-PCR获得CIB开放读框序列,克隆至真核表达载体pCMV-myc,构建表达带myc表达标签的真核表达载体pCMV-myc-CIB,将其转染至NIH3T3细胞中,免疫组化鉴定其在细胞中的表达及定位.结果 序列分析表明克隆的CIB序列与GeneBank报道的序列一致,脂质体转染入NIH3T3细胞中,用myc抗体检测到目的蛋白myc-CIB的表达.结论 pCMV-myc-CIB表达载体构建成功,并在真核细胞中得到了正确表达,CIB蛋白主要定位于细胞质中.
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钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位
目的:构建钙整合素结合蛋白(calcium-and intesrin-binding protein,CIB)的原核表达载体,制备小鼠抗人CIB的多克隆抗体并探讨其亚细胞定位.方法:采用RT-PCR方法从人脑组织扩增CIB的cDNA片段,利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a-CIB,转入BL21(DE3)中,以IPTG诱导BL21(DE3)表达CIB融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白CIB的表达.用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原免疫小鼠制备抗血清,抗血清分别经Protein G、抗原亲和层析后用Western blot及免疫组化方法进行鉴定.结果:通过重组表达获得CIB抗原蛋白,免疫小鼠并纯化抗血清得到特异性的抗CIB抗体,该抗体能检测细胞内源性CIB蛋白的表达;同时免疫组化结果显示:CIB在SHG44、Hhu7细胞株中主要定位于细胞质.结论:成功克隆CIB基因并制备了特异性的小鼠抗人的CIB多克隆抗体,对进一步研究CIB的功能奠定了基础.
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携带钙整合素结合蛋白基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞系的建立
目的:构建钙整合素结合蛋白(CIB)的逆转录病毒表达载体,并建立包装细胞系.方法:质粒pet32-CIB经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB,PCR及双酶切鉴定后,通过脂质体转染导入包装细胞pA317,G418稳定筛选后获得抗性克隆,NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒谪度测定.结果:重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB质粒测序结果与GenBank中序列一致,经PCR及酶切鉴定证实,获得了大约574 bp的基因片段,且正确插入pLXSN-CIB载体中；建立了pA317-CIB包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为6.81 ×105 CFU/mL.结论:pLXSN-CIB结构正确,成功构建了CIB基因的逆转录病毒表达载体并建立了pLXSN-CIB包装细胞系.
