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重组人VEGF121KDR/rGEL融合毒素抗肿瘤药效学研究
目的:建立荷瘤小鼠模型,观察重组人VEGF121KDR/rGEL融合毒素的抑瘤作用,为开发更加安全和有效的新型靶向抗癌药奠定基础.方法:选择人肝癌SMMC-7721细胞、食管癌KYSE-150细胞、胃癌SGC-7901和结肠癌HT-29细胞建立荷瘤小鼠模型;给药后每2～3 d测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线,计算给药组相对肿瘤增长率.结果:在肝癌、食管癌、胃癌和结肠癌4种裸鼠移植瘤模型中,给药组肿瘤增长明显减慢,给药组肝癌裸鼠肿瘤体积为(89.33±56.36) mm3,食管癌为(142.47±58.67) mm3,胃癌为(73.80±31.05) mm3,结肠癌为(79.64±34.46) mm3;对照组肝癌为(328.19±200.27) mm3,食管癌为(474.05±167.42) mm3,胃癌为(172.34±41.78) mm3,结肠癌为(480.26±348.34) mm3.相对肿瘤体积给药组肝癌为5.31±2.13,食管癌为5.72±2.45,胃癌为3.59±1.55,结肠癌为5.82±1.92;对照组肝癌为17.10±6.00,食管癌为23.71±10.36,胃癌为11.65±4.14,结肠癌为23.24±5.74.相对肿瘤增殖率肝癌为31.05％,食管癌为24.12％,胃癌为25.04％,结肠癌为30.82％.给药组肿瘤体积和相对肿瘤体积均显著小于对照组,P值均＜0.01.结论:重组人VEGF121KDR/rGEL融合毒素显著抑制多种肿瘤生长,可能是一种具有临床应用前景的候选靶向抗癌药.
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重组人VEGF121KDR/rGEL融合毒素在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性
目的 在大肠埃希菌中表达具有血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)/KDR(含激酶插入域的受体)特异性的重组人VEGF121KDR/白树籽核糖体失活蛋白(rGEL)融合毒素,纯化后检测其生物活性.方法 将rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素全基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-VEGF121KDR/rGEL,转化大肠埃希菌Origami(DE3),IPTG诱导表达;表达的目的蛋白经SP-Sepharose FF、Ni-Sepharose FF纯化后,用凝血酶酶切,酶切产物经Q-Sepharose FF纯化;以细胞表面分别高表达VEGFR1/FLT1和VEGFR2/KDR的猪动脉血管内皮细胞PAE/FLT1和PAE/KDR为靶细胞,检测纯化的rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素的细胞毒性.结果 重组原核表达质粒pET-32a(+)-VEGF121KDR/rGEL经双酶切和测序证实构建正确;表达的目的蛋白为标签蛋白硫氧化还原蛋白(thioredoxin,Trx)与rhVEGF121KDR/rGEL的融合蛋白,其相对分了质量约为62 000,蛋白呈可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的20％,去除标签蛋白的纯化rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素相对分子质量约为43 000,纯度大于98％;VEGFR2阳性细胞PAE/KDR和VEGFR1阳性细胞PAE/FLT的半数抑制浓度(IC50)分别为0.32和278 nmol/L,后者为前者的800多倍.结论 已成功在大肠埃希菌中表达了rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素,纯化的融合毒素对过度表达VEGFR2的血管内皮细胞具有很强的杀伤作用,为进一步研究其抗肿瘤作用及开发新型靶向抗癌药物奠定了基础.
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抗CD25单克隆抗体治疗银屑病的初步观察
新近对银屑病动物模型的研究证实它是一种免疫性疾病，致病性T细胞比角质形成细胞具有更重要的意义,因而认为该病皮损的发生是基于T细胞的免疫发病机制[1,2]。1991年，Nicolas等[3]首次应用选择性的T细胞免疫抑制剂抗CD4单克隆抗体静脉内注射治疗严重银屑病，疗效良好但不良反应明显。尔后，系统应用选择性针对淋巴细胞的白介素-2（IL-2)与白喉毒素片段的融合毒素（DAB389IL-2)治疗银屑病患者，疗效欠佳,仅40％的患者有效[4]。Basiliximab是抗IL-2受体(CD25)的单克隆抗体，自1997年起用于防止移植排斥的三期临床[5]。我们试用Basiliximab治疗2例严重难治的寻常型银屑病，临床上监测银屑病皮损面积严重指数（PASI)，同时应用流式细胞分析技术监测患者外周血T细胞表面CD25的表达来评价治疗效果。
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食物中毒菌多联融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的表达及免疫学特性研究
目的 构建食物中毒菌多联融合毒素基因及重组表达载体,制备抗5种毒素的血清抗体.方法 采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌的5个毒素基因片段进行串联,并定向克隆到表达载体pET-22b(+)的NcoI和XhoI位点之间,构建五联融合毒素基因及重组表达载体,表达产物经切胶回收初步纯化后免疫獭兔,制备抗血清,利用ELISA和琼脂扩散试验检测抗体和5种毒素反应的特异性和敏感性.结果 构建了重组融合毒素(命名为F5)Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB基因和重组表达载体F5-22b,且在表达宿主菌E.coli BL21中得到有效表达(9.90%),基因序列全长2 937bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,融合蛋白分子量112.369ku,测序结果与设计序列(GenBank)100%同源.表达产物经初步纯化后免疫獭兔获得抗五种毒素的血清抗体,且具有较高的特异性和敏感性.结论 成功构建了融合毒素基因,获得了抗五种毒素的血清抗体,本实验结果为下一步建立食品广谱、快速免疫学检测新方法奠定了基础.
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食物中毒菌多联融合毒素F5基因的构建及结构分析
目的:构建食物中毒菌多联融合毒素基因并分析其是否保持了原来毒素基因的抗原特性.方法:采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌5个毒素基因片段进行串联,构建重组融合毒素Hc-VTIB-SEA-VT2B-SEB(命名为F5)基因,应用DNAstar,对F5融合蛋白抗原特性等进行预测分析.结果:构建的融合毒素F5保留了5种毒素的抗原特性,基因全长序列2 937 bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,测序结果与设计序列(GeneBank)100%同源.结论:成功构建了食物中毒菌多联融合毒素F5基因,为下一步研究融合毒素F5的表达及利用融合毒素检测食物中毒菌毒素建立广谱免疫学检测新方法奠定了基础.
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特异性结合血管内皮生长因子受体2的融合毒素
目的制备特异性结合血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)的融合蛋白,阻断新生肿瘤血管内皮细胞和某些VEGFR-2阳性肿瘤细胞内的蛋白合成,引起细胞死亡.方法运用基因定点突变技术,制成VEGF D63A、E64A、E67A突变体.利用这个可以和VEGFR-2特异性结合的VEGF突变体,代替白喉毒素上的受体结合区,制成了特异性结合VEGFR-2的融合蛋白.结果以去除了受体结合区的DT391作为对照,以VEGFR-2阳性肿瘤细胞做实验,验证了这个融合毒素对VEGFR-2阳性细胞的选择性杀伤作用.结论制备了特异性杀伤血管内皮生长因子受体2阳性细胞的融合毒素.
关键词： 白喉毒素 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体 融合毒素 -
Luffin-β-KDEL-uPAcs融合毒素的构建及其抗胃癌SGC-7901细胞的活性研究
目的 构建含尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点(uPAcs)和KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)驻留信号序列的丝瓜毒素(Luffin-β)基因的原核载体,表达并纯化其融合毒素蛋白Lufin-β-KDEL-uPAcs(LKP),并探讨融合毒素蛋白LKP抗胃癌SGC-7901细胞的活性.方法 RT-PCR两步法克隆Luffin-β基因,引物延伸法构建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,诱导其表达融合蛋白Trx-EK-Luffin-β-KDEL-uPAcs (TELKP)并纯化TELKP,肠激酶(enterokinase,EK)切割TELKP后,纯化与回收目的毒素蛋白LKP,SDS-PAGE对LKP蛋白予以检测鉴定,高效液相色谱法(HPLC)对其进行纯度检测.采用cell counting kit-8 (CCK-8)、RT-PCR、Western blot等方法,体外检测毒素蛋白LKP经uPA酶裂解后释放Luffin-β的抗胃癌SGC-7901细胞的活性.结果 成功诱导重组载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs表达相对分子质量约48.8×103含载体表达标签(Trx)的融合免疫毒素TELKP,EK酶切该蛋白获含290个氨基酸,相对分子质量约31.8×103的目的蛋白LKP.SDS-PAGE检测鉴定表明,LKP蛋白与预期大小一致,其纯度达98.8％.CCK-8、RT-PCR、Western blot等法检测显示,LKP经uPA酶体外裂解可释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素.结论 成功克隆到Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因,并将其构建于原核表达载体pET-32a(+)中,且诱导该载体表达了相对分子质量约31.8×103的融合毒素LKP.LKP毒素经uPA酶体外裂解能释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素.
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食源性致病菌六联融合毒素的构建及免疫学特性研究
[目的]构建4种食源性致病菌融合毒素基因及重组表达载体,制备六联融合毒素的血清抗体. [方法]采用柔性Linker序列(G-G-G-G-S)对目的基因进行串联(HblA-VT1B-SEA-VT2B-BoNTaHc-SEB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在E.coli BL21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫豚鼠制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性. [结果]成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在E.coli BL21中成功表达,37℃表达蛋白主要以包涵体形式存在(表达量10.2%),基因序列全长3 384bp,编码1 127个氨基酸,蛋白分子量为127 205,测序结果与设计序列一致性为100%.ELISA和琼脂扩散试验表明,融合毒素F6与4种食源性致病菌有良好的反应原性,与多种非目标菌不反应. [结论]成功构建了多联融合毒素基因的表达质粒及制备了抗血清,为利用融合毒素的方法检测食源性致病菌,进而建立食源性致病菌广谱、快速的检测方法奠定基础.
