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二甲基乙二酰基甘氨酸对小鼠骨髓间充质干细胞缺血清凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响
目的 观察脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalglycine,DMOG)对无血清培养引起的小鼠骨髓间充质干细胞的凋亡影响及其对凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax表达的影响.方法 分离小鼠股骨及胫骨骨髓腔中的单个核细胞,传代后应用流式细胞仪进行细胞表型检测和三系分化以鉴定骨髓间充质干细胞.流式细胞仪TUNEL法观察DMOG作用于细胞后对细胞无血清培养凋亡的对抗作用,Westerm blot检测DMOG对凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax蛋白表达的影响.结果 实验所获的单个核细胞通过流式细胞仪细胞表型鉴定和三系分化鉴定证实为骨髓间充质干细胞.与无血清造模组相比,二甲基乙二酰基甘氨酸能明显降低骨髓间充质干细胞因缺血清导致的凋亡率(P＜0.05),并上调凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表达(P＜0.05),抑制凋亡促进蛋白Bax蛋白表达(P＜0.05).结论 脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG能抑制骨髓间充质干细胞因缺血清培养引起的凋亡.对凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax表达的调控可能是DMOG对抗骨髓间充质干细胞凋亡的重要机制.
关键词： 脯氨酸羟化酶抑制剂 二甲基乙二酰基甘氨酸 骨髓间充质干细胞 凋亡 -
二甲基乙二酰基甘氨酸促进骨髓间充质干细胞成骨分化
目的 观察二甲基乙二酰基甘氨酸对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的调控作用.化学性低氧模拟物(如二甲基乙二酰基甘氨酸)能够稳定低氧诱导因子,从而在骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化中发挥调控作用.方法 于小鼠股骨及胫骨骨髓腔中分离获得小鼠骨髓单个核细胞,并以流式细胞仪鉴定及传代培养.使用二甲基乙二酰基甘氨酸对细胞进行干预,以便在常氧培养条件下模拟低氧环境.经过不同浓度二甲基乙二酰基甘氨酸干预后,使用MTT法检测细胞的增殖能力,使用碱性磷酸酶定量测定、碱性磷酸酶染色、茜素红钙结节染色评价骨髓间充质干细胞的成骨能力.结果 流式细胞仪鉴定证实从小鼠骨髓腔中所获细胞为小鼠骨髓间充质干细胞.二甲基乙二酰基甘氨酸能够以剂量依赖的方式抑制骨髓间充质干细胞增殖(P＜0.05),但0.5 mM浓度的二甲基乙二酰基甘氨酸能够上调碱性磷酸酶的表达和钙结节的沉积(P＜0.05).结论 表明二甲基乙二酰基甘氨酸能抑制间充质干细胞的增殖,促进间充质干细胞的成骨分化.
关键词： 二甲基乙二酰基甘氨酸 骨髓间充质干细胞 成骨分化 增殖 -
二甲基乙二酰基甘氨酸对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞增殖和分化的影响
目的:探讨低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的增殖、成骨分化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响.方法:将MC3T3-E1细胞接种到培养板24h后,实验组培养基中分别加入50μM (50μM组)和200μM(200μM组)的DMOG,对照组加入完全培养液.分别于培养1、3、5d时采用MTT法检测MC3T3-E1细胞增殖情况,5、10d行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测成骨细胞分化,21d用茜素红染色检测MC3T3-E1细胞钙结节的形成并进行定量分析,采用ELISA法检测MC3T3-E1培养3d情况时上清液中的VEGF蛋白含量,并用实时荧光定量PCR法检测MC3T3-E1细胞VEGF mRNA的相对表达量.结果:培养ld时对照组、50μM组和200μM组的MC3T3-E1的光密度(optical density,OD)值分别为0.041 ±0.009、0.074±0.019、0.086±0.044,3d时分别为0.123 ±0.027、0.148 ±).020、0.224±0.061,5d时分别为0.297±0.044、0.325±0.084、0.354±0.038,1d、3d时50μM组和200μM组与同时间点对照组比较均有显著性差异(P＜0.05),3d时50μM组与200μM组有显著性差异(P＜0.05).培养5d和10d时对照组ALP染色颜色较深,50μM组颜色中等,200μM组颜色较浅;5d时对照组ALP活性为1.943±0.072,50μM组为1.632±0.051,200μM组为1.319±0.065;10d时对照组ALP活性为3.734±0.067,50μM组为3.381±0.070,200μM组为2.831±0.086.三组间同时间点比较均有统计学差异(P＜0.05),同组10d时与5d时比较均有统计学差异(P＜0.05).茜素红染色200μM组可见少量红色结节,50μM组可见中等量红色结节,对照组可见大量红色结节;对照组茜素红含量(μg/ml)为56.178±7.940,50μM组为41.922±2.438,200μM组为31.929± 1.922,三组间比较均有统计学差异(P＜0.05).培养3d时对照组细胞培养上清液中VEGF蛋白含量(ng/孔)为9.063±0.603,50μM组为12.123±0.870,200μM组为15.540±0.581,三组间比较均有统计学差异(P＜0.05);50μM组VEGF mRNA表达量为对照组的1.792±0.067,200μM组为对照组的3.963±0.092,三组间比较均有统计学差异(P＜0.05).结论:低氧模拟剂DMOG可促进MC3T3-E1细胞增殖和VEGF表达,抑制其成骨分化.
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脯氨酰羟化酶抑制剂对PC12细胞SDF-1α表达的影响
目的 研究脯氨酰羟化酶抑制剂对基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1 alpha,SDF-1 α)表达的影响及可能的机制.方法 体外培养PC12细胞,予以不同浓度氯化钴(CoCl2)、去铁胺(DFO)、二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)处理.CCK-8法检测细胞活性,RT-PCR检测药物诱导后细胞内SDF-1αmRNA的表达,Western印迹法和ELISA法分别检测低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、SDF-1α蛋白表达.结果 CCK-8法结果显示,低浓度CoCl2能够促进PC12细胞的增殖能力,但随着浓度增高,DFO、CoCl2、DMOG均能使细胞增殖能力降低.RT-PCR结果显示,DFO、CoCl2、DMOG各组细胞内SDF-1αmRNA表达减少.Western印迹法结果显示,CoCl2、DFO和DMOG组HIF-1α表达量较对照组显著增高.ELISA法结果显示,CoCl2 DFO、DMOG组SDF-1α水平均显著下降.结论 脯氨酰羟化酶抑制剂CoCl2 、DFO和DMOG均可上调HIF-1α的表达,下调SDF-1α的表达.
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二甲基乙二酰基甘氨酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和胶原合成的影响
目的 观察二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、胶原合成的影响.方法 使用不同浓度DMOG分别作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,用噻唑蓝(MTT)法检测其增殖水平的差异和药物半数抑制浓度(IC50)及佳干预时间;并将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为对照组、DMOG组(IC50为800 μmol/L的DMOG)、缺氧组及缺氧+DMOG组(缺氧+800μmol/L的DMOG),作用36 h(佳干预时间)后用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、Western blot检测各组的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达水平;MTT法检测各组细胞的增殖水平,流式细胞仪检测各组的细胞周期;羟脯氨酸比色法检测各组细胞的胶原合成.结果 随着浓度的增加(200、400、800、1 600 μmol/L),DMOG对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖抑制呈剂量时间依耐性;在瘢痕疙瘩成纤维细胞中,缺氧组、DMOG组和缺氧+DMOG组的HIF-1α的蛋白(0.98±0.09、1.36±0.16、1.43±0.21)和mRNA(1.14 ±0.11、1.24±0.16、1.27±0.11)的表达均较对照组的蛋白(0.71 ±0.13)和mRNA(1.01 ±0.02)高(P＜0.01).流式细胞结果显示缺氧组、DMOG组和缺氧+ DMOG组的G0/G1期细胞比例[(56.7±2.2)％、(61.3±3.3)％、(73.4±2.5)％],较对照组[(48.8±2.4)％]明显增加(P＜0.01),S期细胞和G2/M期细胞比例均减少(P＜0.01).与对照组比较,其他3组细胞增殖均受到了抑制,并且其中DMOG组和缺氧+DMOG组培养36 h后细胞吸光度较对照组明显降低(0.54±0.01、0.29±0.02比1.01 ±0.02,P＜0.01);与对照组比较,缺氧组中的羟脯氨酸水平、Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白有均所升高(P＜0.01).与对照组比较,DMOG组和缺氧+ DMOG组中的羟脯氨酸(11.86 ±0.64、14.72±0.03比15.92±0.22)、Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA(0.63 ±0.07、0.86±0.08、0.56 ±0.09、0.82 ±0.10比1.00±0.01、1.00 ±0.03)和蛋白(0.78 ±0.19、1.06±0.18、0.66 ±0.13、0.81±0.10比2.23 ±0.14、1.53 ±0.05)表达均明显降低(P＜0.01).结论 DMOG对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖具抑制作用,并能显著抑制其胶原的合成.
关键词： 二甲基乙二酰基甘氨酸 瘢痕疙瘩 缺氧诱导因子-1α 增殖 胶原 -
低氧诱导因子-1α激动剂对内皮祖细胞生物学行为的影响
目的 观察低氧诱导因子-1α( HIF-1α)的激动剂对兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)的增殖和功能的生物学影响.方法 以不同浓度的HIF-1α的激动剂二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)干预EPCs,检测其增殖活性、集落形成能力、一氧化氮(NO)的产量、迁移能力、衰老状态、成血管功能及相关蛋白的表达.结果DMOG能显著激活EPCs中HIF-1α蛋白表达,增加细胞的活性,且成剂量依赖关系,其中浓度500 μmol/L时增殖作用达到峰值.同时DMOG增加EPCs集落形成能力(P＜0.01),抑制细胞的衰老(P＜0.05),并显著提高EPCs的的迁移能力和体外成血管功能.结论 HIF-1α的激活剂能显著提高内皮祖细胞增殖能力、集落形成能力、迁移能力和成血管功能.
关键词： 内皮祖细胞 二甲基乙二酰基甘氨酸 低氧诱导因子-1α 血管新生 -
低氧与低氧模拟剂对BMSCs成骨分化影响的对比研究
目的 对比低氧培养与常氧条件下低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠BMSCs成骨分化的影响.方法 原代分离培养健康3～4周龄昆明小鼠BMSCs,采用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测,行成骨、成脂、成软骨诱导分化染色鉴定.取第3代BMSCs分为对照组(A组,常氧条件下培养)、低氧培养组(B组,1％O2低氧条件下培养)及DMOG干预组(C组,常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养).分别于培养1、2、3、4d采用MTT法检测BMSCs增殖情况,7、14d检测ALP含量,24h后采用Western blot法检测低氧诱导因子lα(hypoxia inducible factor,HIF-1α)蛋白表达,3、7d采用实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix基因表达,21 d行茜素红染色观察.结果 BMSCs流式细胞术表面标志鉴定示CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD34(-);成骨、成脂、成软骨诱导分化后茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性.MTT法检测示,培养1d,3组细胞增殖比较差异无统计学意义(P＞0.05);2、3、4d,与A组比较,C组均抑制细胞增殖,但差异无统计学意义(P＞0.05);而B组则促进细胞增殖,差异有统计学意义(P＜0.05).培养各时间点,B、C组ALP含量、HIF-1α蛋白相对表达量及RUNX2、Osterix基因相对表达量均显著高于A组,ALP含量及RUNX2、Osterix基因相对表达量C组高于B组,而HIF-1α蛋白相对表达量B组高于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).培养21d茜素红染色示,A组可见少许结节状红染物质,B组可见中等量红染物质,而C组可见大量红染物质.结论 低氧能明显促进BMSCs增殖,DMOG对BMSCs增殖无明显影响;低氧与DMOG均能促进BMSCs成骨分化,且DMOG促BMSCs成骨分化能力更强.
关键词： 低氧 低氧模拟剂 二甲基乙二酰基甘氨酸 成骨分化 小鼠 -
二甲基乙二酰基甘氨酸预处理对大鼠跨区穿支皮瓣成活的影响及相关机制
目的 观察二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)预处理对大鼠跨区穿支皮瓣成活及闭塞区域2血管的影响,并探讨相关机制. 方法 取60只成年SD大鼠,按照随机数字表法分为DMOG组和生理盐水组,每组30只.在2组大鼠背部右侧制作三血管体穿支皮瓣,包括旋髂深动脉穿支、肋间动脉穿支、胸背动脉穿支和闭塞区域1、2.DMOG组大鼠于术前2d、2h及术后2d腹腔注射2 mL含DMOG的生理盐水(DMOG剂量为40 mg/kg),生理盐水组大鼠于相同时相点腹腔注射等量生理盐水.术后7d,行大体观察、计算皮瓣成活率;采用血管造影术观察皮瓣闭塞区域2及潜在区血管情况;HE染色观察皮瓣闭塞区域2的新生血管并计算微血管密度(MVD),免疫组织化学染色法和蛋白质印迹法检测该区域的血管内皮生长因子(VEGF)表达(分别以积分吸光度值与灰度值比值表示),激光多普勒血流成像仪检测该区域血管的血流量.每组各项指标的样本数均为6.对数据行t检验.结果 (1)术后7d,2组大鼠均存活,皮瓣未出现感染.DMOG组大鼠皮瓣的坏死区域大致位于胸背动脉穿支入皮点以远,痂皮呈暗黄色、质地较软;生理盐水组大鼠皮瓣的坏死区域大致位于闭塞区域2以远,痂皮呈棕黑色、质地较硬.DMOG组大鼠皮瓣成活率为(88±3)％,显著高于生理盐水组的(82±3)％(t=3.38,P＜0.01).(2)术后7d,DMOG组大鼠皮瓣闭塞区域2的血管结构较清晰、新生血管较多,潜在区血管结构较完整;生理盐水组大鼠皮瓣闭塞区域2的血管结构模糊不清、新生血管较少,潜在区血管结构较紊乱.(3)术后7d,DMOG组大鼠皮瓣闭塞区域2的MVD为(29.2±2.2)个/mm2,明显多于生理盐水组[(20.3±3.6)个/mm2,t =5.10,P＜0.01].(4)术后7d,DMOG组大鼠皮瓣闭塞区域2 VEGF的免疫组织化学染色法和蛋白质印迹法表达结果分别为5 060±432、0.48±0.04,均明显高于生理盐水组(2 811±382、0.26 ±0.06,t值分别为9.54、5.67,P值均小于0.01).(5)术后7d,DMOG组大鼠皮瓣闭塞区域2血管的血流量为(58±4)灌注单位(PU),明显多于生理盐水组[(46 ±4) PU,t=5.20,P＜0.01]. 结论 DMOG可通过促进大鼠背部跨区穿支皮瓣闭塞区域2的血管新生,改善皮瓣血供,从而提高皮瓣的成活率.
关键词： 创伤和损伤 外科皮瓣 血管内皮生长因子类 闭塞血管 二甲基乙二酰基甘氨酸
