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钙浓度变化对体外培养人表皮角质细胞增殖的影响
目的:比较不同钙浓度培养的人表皮角质细胞(HEKs)增殖能力的差异,确定体外培养表皮角质细胞的适钙浓度.方法:根据培养液中CaCl2浓度不同,将HEKs分为无钙培养组和0.1、0.3、0.5、1.0 mmol/L CaCl2培养组.细胞培养3 h后,加钙离子荧光染料Fluo-3-AM,显微镜观察细胞内的荧光强度,以反映细胞内钙离子浓度的变化;细胞培养2 d后加Hochest33258核染液,荧光显微镜下观察细胞生长形态;培养3 d时镜下观察细胞的生长情况,并分别用流式细胞术和MTT法分析细胞的增殖情况.结果:钙培养可使细胞内钙离子浓度增加,表现为细胞内Fluo-3-AM荧光强度增强,且随着CaCl2浓度的增加,荧光强度亦随之增加;在钙浓度为0.3mmol/L时,细胞的增殖指数高,为(51.98±14.31)%,增殖活性强;0.1mmol/L组次之;随着钙浓度的增加,细胞的增殖指数下降,增殖活性受到抑制,0.5～1.0mmol/L钙培养组的增殖指数和增殖活性均明显低于无钙培养组(P均<0.01).结论:不同钙浓度培养影响表皮角质细胞的增殖能力,钙浓度为0.3 mmol/L时细胞的增殖能力强.
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高钙培养对表皮角质细胞形态和生长特点及角蛋白表达的影响
目的:观察高钙培养后表皮角质细胞的形态、生长特点及角蛋白表达的变化,进一步探讨钙在促进表皮角质细胞分化过程中的重要作用.方法:表皮角质细胞分别在低钙(0.05 mmol/L)和高钙(1.2 mmol/L)环境条件下培养1～2 d,光镜下观察细胞的形态和生长特点,并采用免疫组织化学方法检测表皮角质细胞中角蛋白10(K10)、K14和K19的表达水平.结果:低钙培养的表皮角质细胞散在生长,分布均匀,细胞间隙较大,胞膜圆滑,边界清楚.高钙培养后,细胞胞体变得扁平,细胞间隙消失,并且细胞出现明显的成簇生长趋势.在正常培养即低钙培养条件下,K10和K19阳性细胞比例较少,所培养的细胞几乎全为K14阳性细胞;在高钙培养条件下,K10和K19阳性细胞比例明显增加,而K14的表达没有明显变化.结论:高钙培养能改变表皮角质细胞的形态和生长特点并提商细胞内角蛋白的表达水平,从而促进表皮角质细胞的分化成熟.
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肿瘤坏死因子α诱导位点特异性 DNA去甲基化促进基质金属蛋白酶9的表达
目的：研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导位点特异性 DNA 去甲基化促进人表皮角质细胞基质金属蛋白酶9( MMP9)的表达。方法用10 ng/ ml 的 TNF-α或2.5μmol/ L 的5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(DAC)联合300 nmol/ L 的曲古菌素 A (TSA)处理人表皮角质细胞株 HaCaT 细胞,采用实时荧光定量 PCR (Real-time RT-PCR)检测各组细胞 MMP9 mRNA 水平,采用蛋白质印迹(Western Blot)及酶联免疫吸附法(ELISA)检测 MMP9蛋白的表达水平。应用亚硫酸氢钠修饰后测序法(BSP)及甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(Ms-HRM)检测 TNF-α干预细胞后 MMP9启动子区 DNA 甲基化改变差异大的 CpG 位点。构建不同位点甲基化的 MMP9启动子-荧光素酶报告基因重组质粒,检测特异性位点的 DNA 甲基化状态改变对 MMP9启动子转录活性的影响。结果各培养时间点,TNF-α干预组均较相应 PBS 对照组 HaCaT 细胞的 MMP9表达量升高,且差异均有统计学意义(P<0.05)；经实时 RT-PCR、蛋白质印迹和 ELISA 三种方法分别检测到的 MMP9 mRNA 和蛋白表达量随干预时间的变化趋势一致,均为先升高后下降。 TNF-α干预后MMP9启动子区的10个 CpG 位点均发生不同程度的 DNA 去甲基化改变,其中-36 bp 位点改变的差异有统计学意义(P<0.05)。-36 bp 位点去甲基化后,MMP9转录活性明显提高。 TNF-α干预后 MMP9启动子区的10个 CpG 位点均发生不同程度的 DNA 去甲基化改变,其中-36 bp 位点改变的差异有统计学意义(P<0.05)。-36 bp 位点去甲基化后,MMP9转录活性明显提高。结论 TNF-α通过诱导 HaCaT 细胞MMP9基因启动子-36 bp 位点 DNA 去甲基化上调 MMP9表达。
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低氧诱导因子-1的病毒载体制备及感染效果
目的 制备低氧诱导因子(HIF)-1腺病毒载体并评价其对表皮角质细胞的感染效果.方法 Ad/HIF-1质粒经酶切鉴定后,以4μg质粒转染1.2×106个HEK293细胞,2 d后荧光显微镜下观察转染效率.1周后收集细胞及上清并感染HEK293细胞进行病毒扩增,待扩增的细胞及上清量达300 ml时进行病毒纯化及滴度测定.后用制备的病毒载体感染表皮角质细胞,流式测定其感染效果.结果 Ad/HIF-1质粒酶切鉴定正确;转染或感染HEK293细胞后有绿色荧光蛋白(GFP)表达;获得的腺病毒滴度为1.8×1011PFu/ml.病毒以MOI=50感染表皮细胞,2 d后GFP阳性细胞的比例为97.46%.结论 成功制备了HIF-1腺病毒载体,且感染表皮角质细胞后能得到较高的感染效率,从而为腺病毒介导的基因功能研究提供理论基础.
