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兔髂动脉球囊损伤后血管平滑肌钠氢交换体蛋白变化及阿米洛利对血管狭窄的干预作用
目的通过观察球囊损伤动脉后平滑肌层钠氢交换体(NHE)-1蛋白量的变化及NHE-1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对血管狭窄的干预作用,探讨NHE-1参与血管再狭窄作用机制.方法 32只雄性新西兰白兔随机分为Amiloride干预组12只、球囊损伤组10只、假手术组10只.干预组及损伤组制作球囊损伤模型,干预组于手术前3天开始给予Amiloride 5 mg*kg-1*d-1,损伤组以相同剂量生理盐水腹腔注射;假手术组仅分离动脉不行球囊损伤术.术后饲养28天,取髂动脉以Western blot方法检测平滑肌NHE-1蛋白量;行HE、α-肌动蛋白、Masson三色染色,观察血管管腔、中膜、内膜面积变化、平滑肌细胞增殖、细胞外基质变化情况.结果兔髂动脉球囊损伤后4周出现明显管腔狭窄,新生内膜生长,平滑肌层增生;3组平滑肌NHE-1蛋白量各为0.21±0.02、0.25±0.04、0.11±0.03,P＜0.01,损伤组与假手术组比较差异有统计学意义,P＜0.01,提示球囊损伤后平滑肌NHE-1蛋白量增高,干预组与损伤组比较P=0.05、与假手术组比较P＜0.01,提示经Amiloride干预后平滑肌NHE-1蛋白量有所下降,但仍未达正常水平;干预组、损伤组、假手术组髂动脉管腔面积分别为0.91 mm2±0.23 mm2、0.68 mm2±0.19 mm2、1.08 mm2±0.17 mm2,P＜0.01,新生内膜面积分别为0.27 mm2±0.15 mm2、 0.67 mm2±0.24 mm2、0.05 mm2±0.03 mm2,P＜0.01,内膜/中膜面积比分别为1.21±0.24、1.39±0.26、0.15±0.08,P＜0.01;经Amiloride干预后管腔面积明显增大、内膜面积显著下降、内膜/中膜面积比下降.干预组与损伤组内膜比较,α-肌动蛋白染色阳性面积减小,4164.15 μm2±1788.37 μm2 对16 328.31 μm2±6220.27 μm2,P＜0.01;Masson染色绿色面积下降,8910.62 μm2±7041.62 μm2 对33 358.76 μm2±7290.17 μm2,P＜0.01,提示干预组内膜平滑肌增生及细胞外基质增生均减轻.结论兔髂动脉球囊损伤后,出现血管平滑肌细胞增殖、向内膜迁移、细胞外基质分泌增多,形成新生内膜,管腔缩小,平滑肌层NHE-1蛋白量增高.NHE-1抑制剂Amiloride可抑制球囊损伤兔髂动脉所致血管狭窄,为应用NHE-1抑制剂防止经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄提供依据.
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Na+/H+交换体阻滞剂对糖尿病鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护机制
目的 探讨Na+/H+交换体(NHE)阻滞剂抗糖尿痛心肌细胞内钙超载和抗细胞挛缩作用.方法 利用培养的糖尿病鼠心肌细胞进行缺氧/复氧处理,模拟心肌缺血/再灌注(I/R)损伤,动态监测单个心肌细胞在缺氧/复氧时Ca2+浓度的变化和NHE阻滞剂阿米洛利(EIPA)对其细胞面积和细胞生存的影响.结果 动物模型显示EIPA可以减轻再灌注心肌细胞损伤.在复氧前给予以常规剂量EIPA,虽能有效拮抗细胞挛缩,但不能阻止细胞内钙超载,故未能显著提高心肌细胞的存活率.在复氧前给予大剂量的EIPA或在缺氧/复氧全程常规剂量EIPA给药均能有效地抑制缺氧期和复氧期Ca2+浓度的上升,防止糖尿病鼠细胞内钙超载,同时拮抗细胞挛缩,显著提高细胞的存活率.结论 在缺氧前或复氧前给予常规剂量或增大剂量的EIPA均能有效地拮抗心肌细胞挛缩,发挥其对心肌细胞的保护作用.
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炎症反应中Toll样受体对NHE蛋白家族的调节
Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)在不同的天然免疫应答中可以识别和激活不同的病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs),进而导致炎症.而钠氢交换体(Na+/H+ exchanger,NHE)不仅具有调节胞内pH值和细胞容积、维持腔体微环境、影响营养吸收的作用,而且与细胞的增殖、迁移、凋亡相关.在炎症情况下,NHE的活性和膜蛋白表达都受到抑制.结肠上皮细胞TLR2激活后可通过MyD88非依赖性途径抑制NHE1活性,其抑制作用的机制与Src的聚集和PI3Ks的磷酸化有关.长期脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)暴露可激活肠巨噬细胞TLR4,通过MyD88依赖性途径(即TLR4/MyD88/NF-κB通路)导致炎症发生,并加速NHE1胞内降解,从而抑制NHE1活性;但短时间LPS暴露却提高NHE1活性.TLR5的激活可使NHE3活性增高.结肠炎患者和模型动物肠道巨噬细胞NHE3活性或/和表达量下降.在肾小管上皮细胞中,基底侧LPS刺激通过激活TLR4/MyD 88/MAPK/ERK信号通路抑制管腔侧NHE3的活性,而管腔侧LPS刺激则激活TLR4/MyD88依赖性PI3K-AKT-mTOR信号通路,引起基底侧NHE1活性抑制,进而继发影响管腔侧NHE3功能.
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脂多糖诱导大鼠急性肺损伤中钠氢交换体的表达
目的:建立脂多糖诱导大鼠急性肺损伤实验模型,观察实验模型中大鼠肺组织上钠氢交换体1 mRNA和蛋白的表达水平变化情况.方法:40只(250～350 g)雄性清洁级SD大鼠随机均分成空白对照组(C组)、脂多糖2 h组(L-2 h组)、脂多糖4 h组(L-4 h组)和脂多糖6h组(L-6 h组).监测各组大鼠基本生命体征;光学显微镜下观察大鼠肺组织病理改变;计算急性肺损伤评分和肺组织湿/干重比值;检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白、肿瘤坏死因子-a和巨噬细胞炎性蛋白的浓度;测定肺组织髓过氧化物酶活性;免疫组化、RT-PCR和western Blot检测肺组织钠氢交换体1 mRNA和蛋白的表达水平.结果:空白对照组大鼠肺组织肺泡结构正常,肺泡腔无渗出物;脂多糖各组大鼠肺组织病理改变明显,肺泡间隔增厚,肺泡腔内可见较多的炎性细胞,肺泡腔内有血性渗出液.和空白对照组比较,脂多糖各组大鼠支气管肺泡灌洗液中总蛋白、肿瘤坏死因子-a和巨噬细胞炎性蛋白的浓度均依次明显增高(FTP=31.67、F TNF-α=275.33、F MIP2=239.26,均P＜0.05);肺组织急性损伤评分、湿/干重比、髓过氧化物酶活性、钠氢交换体1的免疫组化表达水平、钠氢交换体1 mRNA和蛋白的表达水平均依次明显增高(F=85.27;F=63.92;F=67.35;F=71.39;F=57.38;F=49.56;均P＜0.05).结论:以6 mg·kg-1的剂量给予大鼠静脉注射脂多糖后4 h就产生了明显的急性肺损伤,表现为大鼠基本生命体征的内毒素休克症状出现;大鼠组织学炎症病理改变;肺组织含水量增加;肺组织及支气管肺泡灌洗液中相关炎性因子增加;与此同时,脂多糖各组大鼠肺组织钠氢交换体1mRNA和蛋白的表达水平也随着急性肺损伤炎症反应的加重而明显增加.
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细胞外信号调节激酶对心肌细胞钠氢交换体调控的作用
目的:探讨细胞外信号调节激酶(ERK)对心肌细胞钠氢交换体(NHE)的调控作用.方法:用氯化铵诱导乳鼠心肌细胞内酸化,用荧光指示剂(BCECF/AM)法测定细胞内pH值,钠氢交换体的活性用酸化后每分钟pH值的变化率(dpHi/dt表示,观察使用ERK特异性抑制剂U0126后对NHE活性的影响；用Western blotting检测心肌细胞ERK蛋白的磷酸化水平.结果:用ERK的选择性抑制剂U0126(3 mol/L)预孵育5 min,与模型组比较,U0126组可以使钠氢交换的活性下降49.46% (P＜0.05)；与模型组比较,ERK的磷酸化水平降低66.5% (P ＜0.05).结论:细胞内酸化激活NHE和ERK的过程中,NHE的激活受到ERK的调控.
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钠氢交换抑制剂对兔髂动脉球囊损伤后血管狭窄干预作用研究
目的:建立兔髂动脉球囊损伤模型,观察钠氢交换(NHE)抑制剂(Amiloride)对血管狭窄的干预作用.方法:32只新西兰白兔随机分为干预组(12只)、对照组(10只)及假术组(10只);建立兔髂动脉球囊损伤模型.干预组于术前3 d予Amiloride[5 mg/(kg*d)]、对照组以相同剂量NS腹腔注射,至术后28 d取材;取髂动脉行苏木精-伊红染色、α-actin免疫组化染色、Masson三色染色,观察血管管腔、中膜与内膜面积变化、平滑肌细胞增殖、细胞外基质(ECM)变化情况. 结果:兔髂动脉球囊损伤后4周出现明显管腔狭窄,新生内膜生长,平滑肌层增生;干预组、对照组、假术组髂动脉管腔面积各为(0.91±0.23)mm2、(0.68±0.19)mm2、(1.08±0.17)mm2,F=7.631,P＜0.01;新生内膜面积各为(0.27±0.15)mm2、(0.67±0.24)mm2、(0.05±0.03)mm2,F=36.974,P＜0.01;内膜/中膜面积比各为1.21±0.24、1.39±0.26、0.15±0.08,F=7.562,P＜0.01;经Amiloride干预后管腔面积明显增大,内膜面积显著下降,内膜/中膜面积比下降.干预组与对照组内膜比较,α-actin染色阳性面积减小[(4 164.15±1 788.37)μm2 vs.(16 328.31±6 220.27)μm2,P＜0.01];Masson染色绿色面积下降[(8 910.62±7 041.62)μm2 vs(333 558.76±7 290.17)μm2,P＜0.01],提示干预组内膜平滑肌增生及ECM增生均减轻. 结论:Amiloride可抑制球囊损伤兔髂动脉所致血管管腔缩小、内膜增生、分泌ECM,减轻血管狭窄,提示其可能在预防经皮冠状动脉内成形术术后血管再狭窄起一定作用.
