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糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1的表达和作用
目的 观察糖尿病肾病大鼠肾小球叉头状转录因子O1( FoxO1)的表达,探讨其与糖尿病肾病发生、发展的关系.方法 8周龄健康雄性SD大鼠30只,链脲佐菌素(STZ)诱导建立糖尿病大鼠模型,采用随机数字表法分为糖尿病组(13只,普通饲料连续喂养4周)和糖尿病肾病组(13只,普通饲料连续喂养12周).选取健康同龄大鼠18只作为正常对照组(NC组).4、12周末检测体质量(BW)、血糖(BG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24h尿蛋白(UPro/24 h)及尿白蛋白定量(UAIb).处死动物后计算肾重指数(KI)；分光光度计测定大鼠肾皮质丙二醛( MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性；免疫组化法检测肾小球FoxO1蛋白、胶原Ⅳ及纤连蛋白水平；RT-PCR检测肾皮质FoxO1mRNA水平；光镜及电镜下观察肾脏组织形态学变化.组间比较采用独立样本t检验.结果 糖尿病肾病组肾皮质MDA蛋白、肾小球胶原Ⅳ和纤连蛋白水平显著高于糖尿病组[分别为(3.49±0.31) vs(2.34±0.28) nmol/mg Prot,20.1 ±1.3 vs 10.1±1.0,10.6±1.3 vs6.3±1.0,t值分别为9.290、20.967、9.119,均P＜0.05]；糖尿病肾病组肾皮质SOD活性蛋白、FoxO1 mRNA表达水平明显低于糖尿病组[分别为( 23±8)vs (43±6) U/mg Prot,0.20±0.06 vs 0.35±0.05,t值分别为7.069、6.717,均P ＜0.05].FoxO1蛋白表达水平各组间比较无显著差异(均P＞0.05).结论 糖尿病肾病大鼠肾皮质FoxO1 mRNA表达水平降低,其机制可能通过下调其抗氧化靶基因使肾脏氧化应激反应增强,从而参与糖尿病肾病发生发展的过程.
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过表达叉头状转录因子O1对高糖下足细胞氧化应激的影响及机制
目的 研究过表达叉头状转录因子O1(FoxO1)对高糖条件下小鼠足细胞及线粒体功能的影响及机制.方法 分别采用过表达FoxO1的慢病毒(LV-CA-FoxO1)和空病毒(LV-NC)感染条件永生性小鼠肾足细胞,在不同糖浓度(正常糖5.5 mmol/L、高糖25.0 mmol/L)下培养72 h.实验分为正常糖组、高糖组、FoxO1组(高糖+LV-CA-FoxO1)和NC组(高糖+LV-NC)共4组,分别检测各组细胞FoxO1表达情况、线粒体及细胞功能指标.多组间比较采用方差分析,组内比较采用SNK法.结果(1)与高糖组比较,FoxO1组FoxO1转录活性增加[(0.94±0.06)比(2.72±0.27),q=3.77,P<0.05];活性氧簇和丙二醛量减少(q=9.22、2.44,均P<0.05),线粒体膜电位上升,线粒体结构损伤减轻;(2)FoxO1组较高糖组足细胞蛋白nephrin、podocin和podocalyxin表达增加(q=2.18、5.87、5.65,均P<0.05),单层屏障功能改善,凋亡率下降(q=6.96、8.99,均P<0.05);(3)FoxO1组较高糖组中PTEN诱导激酶1(PINK1)、parkin mRNA水平上升,线粒体动力相关蛋白1 mRNA下降(q=1.46、7.50、1.89,均P<0.05).与高糖组比较,FoxO1组PINK1蛋白表达水平上升(q=2.36,P<0.05).NC组与高糖组各项指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 过表达FoxO1可减轻高糖诱导的小鼠足细胞线粒体及细胞功能损伤,可能通过激活PINK1/parkin途径实现.
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叉头状转录因子O1对糖尿病大鼠足细胞影响的实验研究
目的 探讨叉头状转录因子O1(Fox01)对糖尿病大鼠足细胞的影响.方法 链脲佐菌素(STZ)诱导构建糖尿病大鼠模型90只,并采用简单随机抽样法分为糖尿病(DM)+空慢病毒载体(LV-pSC-GFP)感染组(LV-NC组,n=30),DM+大鼠结构性活性FoxO1慢病毒载体(LV-CA-FoxO1)感染组(LV-CA组,n=30),DM组(n=30),另设对照组(NG组,n=30)注射相应体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液.于慢病毒感染后的2、4、8周末,测大鼠尿白蛋白、体重、血糖、血肌酐、尿素氮,光镜和透射电镜观察肾小球及其足细胞结构变化,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting法检测大鼠肾皮质中FoxO1、足盂蛋白(PCX)、nephrin mRNA和蛋白的表达.多组间比较采用单因素方差分析.结果 与LV-NC、DM组相比,LV-CA组大鼠肾脏中FoxO1 mRNA、蛋白表达水平明显升高(F8W值分别为10 919.75、3 867.34,均P＜0.05),尿白蛋白、血肌酐、尿素氮明显降低(2周除外)(F8W值分别为132.72、187.68、503.69,均P＜0.05),肾脏中PCX、nephrin mRNA和蛋白水平明显升高(mRNA F8w值分别为778.94、478.10;蛋白F8W值分别为393.64、255.79,均P＜0.05),肾脏病理学变化也明显改善,可见肾小球体积减小,系膜细胞及基底膜增生程度降低,足突融合也有一定程度改善.结论 通过靶向注射慢病毒载体来上调FoxO1的表达可改善DM大鼠足细胞的损伤.
关键词： 糖尿病肾病 叉头状转录因子O1 足细胞 podocalyxin nephrin -
促红细胞生成素通过叉头状转录因子O1-糖原合酶激酶3β信号改善棕榈酸诱导HepG2细胞糖代谢
目的：观察促红细胞生成素（EPO）处理对棕榈酸（PA）诱导HepG2细胞糖异生及糖原合成的影响及作用机制。方法250μmol/L的PA作用HepG2细胞24 h，分别用5、10 U/ml EPO作用24 h，另外，EPO处理的HepG2细胞分别加入磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）特异性抑制剂LY294002或渥曼青霉素(wortmannin)预孵育1 h。比色法检测HepG2细胞糖原含量，Western blotting检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、PI3K蛋白表达、蛋白激酶B（AKT）、叉头状转录因子O1（FOXO1）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）表达。多组间比较采用方差分析。结果与PA处理组相比，5 U/ml和10 U/ml EPO处理组细胞下游分子GSK-3β（分别为1.02±0.03比0.74±0.11、1.06±0.02比0.74±0.11，t=4.236、4.996，均P<0.05）及FOXO1磷酸化水平明显增强（分别为0.99±0.05比0.73±0.09、1.13±0.06比0.73±0.09，t=4.798、6.757，均P<0.05）。与EPO治疗组比较，加入抑制剂LY294002或wortmannin后，GSK-3β（0.68±0.09比1.12±0.14、0.76±0.10比1.12±0.14，t=-4.632、-3.655，均P<0.05）及FOXO1（0.92±0.02比1.15±0.06、0.72±0.07比1.15±0.06，t=-6.532、-7.984，均P<0.05）磷酸化水平均明显被抑制。结论在PA诱导的HepG2细胞，EPO可能通过PI3K/AKT介导的FOXO1、GSK-3β通路改善糖代谢。
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叉头状转录因子O1对糖尿病大鼠足细胞Ⅳ型胶原和desmin表达的影响
旨在探讨叉头状转录因子O1(FoxO1)对糖尿病大鼠足细胞Ⅳ型胶原和结蛋白(desmin)表达的影响.建立糖尿病大鼠模型,随机分为糖尿病+空慢病毒载体(LV-pSC-GFP)感染组(LV-NC组)、糖尿病+大鼠结构性活性FoxO1慢病毒载体(LV-FoxO1-AAA)感染组(LV-CA组)、糖尿病组(DM组),另设对照组.于慢病毒感染后的2、4、8周末,测大鼠尿白蛋白、体重、血糖、血肌酐、尿素氮,光镜和透射电镜下观察肾小球及其足细胞结构变化,实时定量PCR和Western印迹法检测大鼠肾皮质中FoxO1、Ⅳ型胶原α3链(COL4A3)、Ⅳ型胶原α5链(COL4A5)、desmin mRNA和蛋白的表达.与LV-NC、DM组相比,LV-CA组大鼠肾脏FoxO1 mRNA、蛋白表达水平明显升高(P＜0.05),尿白蛋白、血肌酐、尿素氮明显降低(2周除外)(P＜0.05),肾脏中COL4A3、COL4A5、desmin mRNA和蛋白水平也明显降低(P＜0.05),肾脏病理学变化有明显改善.通过靶向注射慢病毒载体来上调FoxO1的表达可改善糖尿病大鼠足细胞Ⅳ型胶原和desmin的异常表达.
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siRNA沉默FoxO1对STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜IL-1β的影响及其作用机制
目的:探讨抑制叉头状转录因子O1(FoxO1)表达对糖尿病大鼠视网膜IL-1β的影响及其作用机制.方法:将人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)用不同浓度葡萄糖处理后,采用RT-PCR和Western blot检测细胞FoxO1、IL-1β表达.HRCECs按照处理方式分为空白对照组(Mock组)、阴性对照组(NC-FoxO1组)和si-FoxO1组(si-FoxO1组),RT-PCR检测各组细胞FoxO1、IL-1β mRNA表达,Western blot检测各组细胞FoxO1、IL-1β、p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达.60只大鼠随机分为对照组(Control组)、DM组、si-FoxO1转染组(LV-si-FoxO1组)和空病毒转染组(LV-NC组),DM组、LV-si-FoxO1组、LV-NC组建立糖尿病大鼠模型,造模成功后向大鼠玻璃体腔注射LV-si-FoxO1或LV-NC慢病毒载体,注射12周后分离视网膜组织,分别采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blot检测大鼠视网膜组织FoxO1、IL-1β表达.结果:与5 mmol·L-1葡萄糖浓度组比较,15 mmol·L-1浓度组FoxO1、IL-1β mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05),25 mmol·L-1浓度组FoxO1、IL-1β mRNA和蛋白表达明显高于5 mmol·L-1浓度组,而35 mmol·L-1浓度组FoxO1、IL-1β mRNA和蛋白表达增加的更明显,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05).si-FoxO1组IL-1β mRNA和蛋白表达明显低于NC-FoxO1组和Mock组(P＜0.05),NC-FoxO1组和Mock组IL-1β mRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).DM组和LV-NC组FoxO1、IL-1β mRNA和蛋白表达明显高于Control组和LV-si-FoxO1组(P＜0.05),LV-NC组与Control组FoxO1、IL-1β表达差异无统计学意义(P＞0.05),DM组和LV-NC组FoxO1、IL-1β表达差异无统计学意义(P＞0.05).si-FoxO1组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显低于NC-FoxO1组和Mock组(P＜0.05),NC-FoxO1组和Mock组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:高糖能够诱导HRCECs FoxO1、IL-1β表达增加,抑制FoxO1表达可能是通过降低MAPK磷酸化下调HRCECs细胞IL-1β表达实现的.
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高脂肥胖大鼠肝脏组织中叉头状转录因子O1的表达及其与糖脂代谢的关系
目的:观察高脂肥胖大鼠肝脏组织巾叉头状因子O1(FoxO1)的表达,探讨其与血糖、血脂代谢的关系.方法:雄性SD大鼠30只,随机分为对照组(10只,给予常规饲料)和高脂组(20只,给予高脂饲料),共饲养10周.饲养期未取符合肥胖标准的16只大鼠定为肥胖组.检测2组大鼠窄腹血糖(FBG)、胰岛素(Ins)、甘油三酯(TG)、总胆同醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇指数(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;采朋稳态模型指数(HOMA-IR)评价胰岛素抵抗程度;实时荧光定量RT-PCR检测2组大鼠肝脏FoxO1 mRNA的表达.结果:饲养10周后,肥胖组大鼠FBG、Ins、TG、TC、LDL-C和HOMA-IR水平均较对照组升高(t分别为1.952、25.566、8.642、5.845、9.922和23.234,P均＜0.05).与对照组的(19.3±5.1)相比,肥胖组大鼠肝脏FoxO1 mRNA表达量(35.6±4.4)增加(t=8.649,P＜0.001).肥胖组大鼠肝脏FoxO1 mRNA表达与FBG(r=0.565,P=0.004)、Ins(r=0.564,P=0.004)、TG(r=0.626,P=0.001)和HOMA-IR(r=0.578,P=0.003)呈正相关.结论:高脂肥胖大鼠肝脏组织中FoxO1的表达量升高,且其与血糖、血脂代谢有关,可能参与肥胖和胰岛素抵抗的发病.
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叉头状转录因子O1基因过表达慢病毒载体构建及其大鼠系膜细胞株的建立
目的 构建含组成性激活突变型FoxO1(CA-FoxO1)基因的过表达慢病毒载体,并建立其过表达的大鼠肾小球系膜细胞株.方法 通过四质粒合成法构建包含CA-FoxO1编码序列的过表达慢病毒载体(LV-CA-FoxO1).实验分为3组:空白对照组(NC组)、空慢病毒载体阴性对照组(LV-empty-FoxO1组)和过表达慢病毒载体组(LV-CA-FoxO1组).培养系膜细胞(RMCs)72h后,用流式细胞仪检测RMCs中绿色荧光蛋白(GFP)阳性率,并采用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测FoxO1的mRNA及蛋白表达情况.结果 成功构建LV-CA-FoxO1,其病毒滴度为1×108 TU/ml.LV-empty-FoxO1组和LV-CA-FoxO1组GFP阳性率分别为84.5％和81.4％;与NC组相比,LV-CA-FoxO1组FoxO1的mRNA与蛋白表达量相当于NC组的27.92倍与5.41倍(均P＜0.05);而NC组与LV-empty-FoxO1组FoxO1的mRNA及蛋白表达量差异均无统计学意义.结论 成功构建了大鼠FoxO1基因的过表达慢病毒载体,并建立了稳定过表达FoxO1的大鼠肾小球系膜细胞株,为进一步研究FoxO1的功能和作用机制奠定了研究基础.
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骨钙素对小鼠3T3?L1细胞分化的影响及与irt2/FoxO1关系的研究
目的:观察骨钙素对小鼠3T3?L1前脂肪细胞分化的影响及对Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的影响,探讨骨钙素通过Sirt2/FoxO1通路控制肥胖、改善胰岛素抵抗、遏制2型糖尿病的机制.方法:将细胞接种到培养板中,加入诱导分化剂诱导其分化.用ELISA法检测各组中Sirt2、FoxO1以筛选佳骨钙素剂量;油红O染色,观察细胞形态及脂肪含量变化,分光光度计510 nm波长处测量OD值.Real?Time PCR法检测各组中Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的表达.结果:骨钙素与Sirt2及FoxO1呈正相关(P<0.05).A组细胞中Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的mRNA表达量均较B组升高(P<0.05).C组细胞中Sirt2、FoxO1、GLUT4和脂联素的mRNA表达量较A组降低(P<0.05).B、C组OD值明显高于A组(P<0.05).结论:骨钙素可能通过Sirt2/FoxO1通路发挥作用调节脂联素及GLUT4的表达从而控制肥胖、改善胰岛素抵抗、可能有遏制2型糖尿病发生发展的作用.
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FOXO1表达改变在糖尿病视网膜病变中的关联性研究
目的 研究糖尿病视网膜病变(DR)患者FOXO1基因表达改变,进一步了解DR的发病机制,为DR的治疗提供新的基因靶点和依据.方法 收集眼科、内分泌科住院部及门诊糖尿病(DM)患者的临床资料,分为DR组110例,糖尿病正常眼底组(NDR) 120例.以荧光定量PCR方法检测FOXO1 mRNA表达水平,用Westernblot检测FOXO1蛋白表达水平.结果 DR组与NDR组相比,FOXO1 mRNA表达在DR组中显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);DR组中FOXO1蛋白表达水平水平相比较NDR组明显增高(P＜0.05).结论 FOXO1在DR中的表达明显改变,这可能为DR提供潜在的治疗靶点.
