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人谷氧还蛋白基因的分子克隆及表达
目的:克隆人脐静脉内皮细胞谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)编码区的cDNA序列并进行序列测定,构建原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.方法:从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,采用RT-pCR技术,获得该基因编码区的cDNA,并重组入原核克隆表达载体pRSETA,构建重组质粒pRSET-Grx,通过菌落PCR筛选及限制性内切酶鉴定,选择阳性克隆并测序.将测序正确的重组质粒pRSET-Grx 转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.结果:将所得序列与GenBank提供的序列(NM002064)比较,测出的序列在核苷酸序列上有一处碱基不同,但在氨基酸序列上与已知序列一致.经IPTG诱导4-5 h后,150 g/LSDS-PAGE分析,表达出Mr16000的蛋白.结论:从人脐静脉内皮细胞中成功地获得Grx编码区的cDNA,成功构建了原核融合表达载体pRSET-Grx并获得表达.
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新诊断2型糖尿病患者血清谷氧还蛋白水平与胰岛素抵抗的相关性
目的 观察新诊断2型糖尿病(T2DM)患者血清谷氧还蛋白(Grx)水平与胰岛素抵抗的相关性.方法 选择2016年1～5月在河北省唐山市人民医院(以下简称“我院”)内分泌科就诊的新诊断T2DM患者90例作为T2DM组,同时从我院健康体检中心选取非糖尿病健康人群70例作为正常组.观察两组年龄、性别、体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP),收集其临床检验结果,包括空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹胰岛素(FINS)、谷氧还蛋白(Grx)等,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR).结果 两组FPG、HbA1c、HOMA-IR、FINS、Grx比较,差异有统计学意义(P＜0.05).两组年龄、性别、BMI、SBP、DBP、TC、TG、HDL、LDL比较,差异无统计学意义(P＞0.05).相关性分析发现,Grx与HbA1c(r=0.607,P=0.007)、FINS (r=0.129,P=0.012)、HOMA-IR (r=0.189,P=0.020)呈正相关;多元线性逐步回归分析显示,Grx与HbA1c(b=1.979,P=0.000)、FINS(b=0.805,P=-0.018)、HOMA-IR(b=0.783,P=0.022)呈正相关.结论 血清Grx表达水平升高可能与拮抗导致胰岛素抵抗的因素、HbA1c有关.Grx表达水平升高可能与胰岛素抵抗、T2DM的发生和发展有关.
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H2O2对ECV304细胞Grx mRNA表达的影响
目的通过体外实验,研究H2O2对人脐静脉内皮细胞(ECV304)谷氧还蛋白(Grx)mRNA表达水平的影响.方法体外培养人脐静脉内皮细胞(ECV304);MTT实验观察H2O2对ECV304细胞增殖的影响;在时间相关性研究中,将细胞分为6组,第1组为正常对照组,第2、3、4、5、6组分别给予终浓度100μmol/L H2O2作用5min、10min、30min、60min、120min;在剂量相关性研究中,将细胞分为6组,第1组为正常对照组,第2、3、4、5、6组分别给予终浓度100μmol/L、200μmol/L 、300μmol/L 、400μmol/L 、500μmol/L H2O2作用30min,采用Trizol一步法提取细胞总RNA,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究各组细胞Grx mRNA表达水平的差异.结果 MTT结果表明,100μmol/L H2O2对细胞增殖无影响,200～500μmol/L H2O2均在不同程度上抑制细胞增殖(P<0.05).RT-PCR结果显示,在时间相关性研究中,终浓度100μmol/L H2O2作用10min、30min、60min均能使ECV304细胞中Grx mRNA表达水平增高,30min达到大值,差异显著(P<0.05);剂量相关性研究表明,终浓度100μmol/L H2O2～400μmol/L H2O2作用30min均能使Grx mRNA表达水平增高,差异显著(P<0.05),其中终浓度300μmol/L H2O2可使Grx mRNA的表达量高(P<0.01).结论 H2O2影响人脐静脉内皮细胞Grx mRNA的表达水平.
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谷氧还蛋白与氧化应激状态
氧化应激(Oxidative Stress)状态是组织氧化损伤的表现,氧化应激与衰老、心脑血管病、神经退行性疾病、糖尿病、白内障、免疫系统疾病、肿瘤等多种疾病发病机理密切相关.谷氧还蛋白(Glutaredoxin,Grx)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,具有多种生物学功能,在细胞内氧化还原平衡状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用,Grx特异的恢复氧化应激损伤产生的谷胱甘肽化蛋白活性的能力可能会使其成为热点药物.
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重组人谷氧还蛋白1对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用
目的 探讨重组人谷氧还蛋白1(rhGrx1)对小鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用及机制.方法 线栓法制备小鼠脑缺血/再灌注模型,病理形态学方法证实模型建立成功.小鼠尾静脉注射rhGrx1(5 mg·kg-1和10 mg·kg-1)后,观察脑组织中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)及蛋白质羰基含量的变化,Western blot检测小鼠脑组织中p38MAPK表达水平的变化.结果 HE染色证实模型建立成功且提示rhGrx1可改善缺血/再灌注损伤所致的小鼠脑组织病理形态学变化;rhGrx1能增加小鼠脑组织LDH、SOD活性、降低蛋白质羰基的含量.与假手术组小鼠相比,缺血和再灌注时脑组织p38MAPK蛋白表达量明显增加,注射rhGrx1后p38MAPK蛋白表达被抑制.结论 rhGrx1对局灶性脑缺血/再灌注损伤小鼠有一定保护作用,其机制可能与抑制p38MAPK蛋白表达相关.
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紫外线照射诱导的人晶状体上皮细胞中谷氧还蛋白2上调对细胞凋亡的抑制作用
目的 观察不同能量紫外线(UV)B照射对人晶状体上皮细胞(LECs)的损伤作用及细胞线粒体中谷氧还蛋白2(Grx2)的表达变化,探讨Grx2对UVB诱导的人LECs凋亡的抑制作用.方法 对HLE-B3进行体外培养,以不同能量的UVB(0、10、30、50 mJ/cm2)(波长297 nm)分别照射培养的细胞,分别于照射后2、4、8、12和16 h在光学显微镜下观察细胞形态变化;采用细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组细胞的存活率;采用TUNEL法测定各组细胞的凋亡率;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中Grx2 mRNA及其蛋白的相对表达量.用pcDNA3.1-Grx2质粒转染培养的细胞构建Grx2过表达模型,以pcDNA3.1空质粒转染组作为对照,并以UVB照射转染的细胞,采用TUNEL法检测各组细胞的凋亡率.结果 细胞培养过程中未照射组细胞贴壁生长,细胞伸展良好,细胞中Grx2表达呈绿色荧光.UVB照射的细胞皱缩变小,死亡细胞增多,10、30、50 mJ/cm2 UVB照射后随着UVB剂量增加和照射时间延长细胞存活率逐渐下降,凋亡细胞逐渐增多.10 mJ/cm2 UVB照射组和30 mJ/cm2 UVB照射组照射后4h,细胞中Grx2 mRNA相对表达量分别为2.53±0.48和3.53±0.14,均明显高于未照射组的1.01±0.08和1.00±0.09,50 mJ/cm2 UVB照射组照射后1h细胞中Grx2 mRNA相对表达量为15.30±3.01,明显高于未照射组的1.00±0.07,差异均有统计学意义(均P＜0.05);各照射不同时间后细胞中Grx2蛋白相对表达量变化趋势与mRNA相同.50 mJ/cm2 UVB照射后4h Grx2转染组细胞凋亡率为(15.34±1.71)％,明显低于空质粒组的(22.11±2.46)％,差异有统计学意义(t=3.189,P＜0.05). 结论 不同能量UVB照射后诱导的人LECs凋亡和损伤程度呈UVB能量依赖性和照射时间依赖性,各剂量UVB照射LECs后细胞中Grx2表达量均表现为一过性上调,Grx2表达量增加对UVB诱导人LECs凋亡有抑制作用.
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氧化应激对血管内皮细胞Grx表达的研究
目的 采用体外实验,研究人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是否受氧化应激而高表达Grx.方法 体外分离培养HUVEC;用不同浓度H2O2处理HUVEC,MTT法检测HUVEC活力.RT-PCR半定量检测Grx mRNA表达水平的差异.结果 成功获得体外培养的HUVEC;300～500 μmol/L H2O2均在不同程度上抑制细胞增殖(P＜0.05).RT-PCR结果表明,Grx mRNA的表达随着200μmol/L H2O2作用时间的增加而增加,30min时与正常对照组差异显著(P＜0.01);不同终浓度H2O2作用30min结果表明,300 μmol/L H2O2作用可使Grx mRNA的表达量高(P＜0.01).结论 建立了分离培养HUVEC的方法;氧化应激可上调HUVEC Grx mRNA表达,且HUVEC内Grx的表达与H2O2刺激呈时间剂量依赖关系.
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血浆谷氧还蛋白水平与新诊断2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化的相关性研究
目的 探讨血浆谷氧还蛋白(Grx)水平与新诊断2型糖尿病(T2DM)患者颈动脉粥样硬化(CAS)的相关性.方法 选取2016年1月~2016年5月于唐山市人民医院内分泌科就诊的新诊断T2DM患者100例作为研究对象.根据颈动脉超声检查结果将其分为CAS组(CAS组,n=52例)和非CAS组(NCAS组,n=48例).同时从该院健康体检中心选取非糖尿病健康人群55例作为正常对照组(NC组,n=55例).记录其年龄、性别、体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP),收集其临床检验结果,包括空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1C)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)及超敏C反应蛋白(hs-CRP).采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆Grx水平.结果 3组间Grx水平比较结果显示,CAS组和NCAS组均高于NC组,CAS组高于NCAS组(均P<0.05);在T2DM患者中,Grx与HbA1c、hs-CRP均呈正相关(均P<0.05);在T2DM患者中,经Logistic回归分析发现,年龄(O^R=1.225,P=0.021)、HbA1c(O^R=1.754,P=0.016)、Grx(O^R=1.556,P=0.009)均为其CAS发生的危险因素.结论 新诊断T2DM患者血浆Grx与其CAS相关,提示Grx可能参与了CAS的发生及发展.
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HSPB1对心肌细胞氧化应激时氧化还原状态的影响
目的：本研究主要探讨HSPB1如何调控细胞的氧化还原状态从而发挥抗心肌损伤的作用。方法：以过氧化氢（ H2 O2）诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤为模型，转染HSP25表达质粒或小分子干扰RNA，观察细胞存活率、LDH水平、细胞凋亡、活性氧水平、谷胱甘肽含量和GSH／GSSG比值的变化，非还原变性蛋白质印迹检测谷氧还蛋白1（Trx1）、谷胱甘肽过氧化物酶（ GR）氧化还原状态的改变。结果：HSPB1过表达抑制H2 O2所致的LDH释放以及caspase 3和PARP的断裂；HSPB1过表达不能减少过氧化氢引起的活性氧水平增加和不能增加细胞内GSH的含量，但可抑制H2 O2所致的GSH／GSSG比值的降低。非还原性蛋白质印迹显示HSPB1过表达明显减少了H2 O2所致的GR和Trx1的氧化。 HSPB1表达下调促进H2 O2所致的细
胞死亡、LDH释放以及caspase 3和PARP的断裂，以及GSH／GSSG比值的下降；同时，非还原性蛋白质印迹显示HSPB1表达下调明显增加了H2 O2所致的GR和Trx1的氧化。结论：HSPB1在心肌细胞氧化应激损伤中通过调控GR和Trx1的氧化还原状态起到抗细胞凋亡的作用。 -
过氧化氢对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白表达的影响
目的 采用体外研究方法 探讨过氧化氢(H<,2>O<,2>)对原代人结肠上皮细胞谷氧还蛋白(Grx)表达的影响.方法 体外分离培养原代人结肠上皮细胞;通过相同浓度H<,2>O<,2>或不同浓度H<,2>O<,2>刺激原代人结肠上皮细胞,使细胞处于氧化应激状态,应用MTT比色法检测不同浓度的H<,2>O<,2>对细胞活力的影响,半定量RT-PCR检测H<,2>O<,2>对细胞Grx基因表达的影响.结果 400 μmol/L以上的H<,2>O<,2>降低细胞活力,300μmol/L浓度的H<,2>O<,2>在一定时间内随刺激时间的延长Grx基因表达相应增加(P<0.05),且在各时间点与对照组相比,H<,2>O<,2>组Grx基因表达均显著增加,在30 min时表达量多;在300 μmol/L以下,随着H<,2>O<,2>浓度的增加,Grx基因表达水平亦相应增加(P<0.05),而500 μmol/L浓度的H<,2>O<,2>组Grx基因表达与400μmol/L组相比有所下降(P<0.05).结论 H<,2>O<,2>引起的氧化应激可明显上调原代人结肠上皮细胞Grx基因的表达,可能在基因水平上参与了对抗H<,2>O<,2>的的作用,但另一方面也赋予了细胞良好的抗凋亡能力,值得深入探讨.
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谷氧还蛋白在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导脐静脉内皮细胞氧化应激中的作用
目的 从基因和蛋白水平研究谷氧还蛋白(Grx)在牙龈卟啉单胞菌脂多糖(LPS)诱导脐静脉内皮细胞(EA-hy926细胞)时的表达变化及其对Akt通路的调控作用.方法 采用牙龈卟啉单胞菌的LPS(1 000 ng·mL-1)对EA-hy926细胞进行不同时间段(4、12、18、24 h)的刺激诱导,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测细胞grx1基因的表达变化;然后加入Grx特异性抑制剂氯化亚硝脲(BCNU),使用Westem blot法检测对照组、LPS组(1 000 ng.mL-1LPS刺激12h)和BCNU组(25 μmol.mL-1BCNU预处理30 min+1 000 ng·mL-1LPS刺激12h)的Grx、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达情况.结果 LPS诱导下,EA-hy926细胞的grx1基因表达量在各个时间段均上调,12h时grx1表达量高.LPS诱导12h时,LPS组的Grx蛋白表达量较对照组明显升高(P＜0.05),而BCNU可有效抑制Grx蛋白的表达(P＜0.05);Akt蛋白表达量在各组间无明显差异(P＞0.05),而LPS组的磷酸化Akt活性升高,显著高于对照组和BCNU组(P＜0.05),与Grx蛋白的表达趋势一致.结论 LPS可以从基因和蛋白水平诱导Grx的表达;Grx是Akt的潜在调节因子,可能对LPS刺激下Akt的调控具有重要意义.
