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boxA及上游序列缺失突变对λ噬菌体抗转录终止功能的影响
目的研究λ噬菌体表达调控机理,阐明PL操纵子boxA及邻近序列突变对抗转录终止作用的影响. 方法利用体内同源重组技术,使大肠杆菌染色体DNA上携带了CI857,PL,nutL[boxA*(*代表不同的boxA及临近序列缺失突变)、boxB],N-lacZ,ttt,galK单拷贝基因,构建了含boxA及邻近序列突变(boxA*)的一系列新菌株,模拟了λ噬菌体感染宿主菌后的生理状态,利用抗转录终止报道基因galK分析研究了boxA及临近序列突变对PL操纵子抗转录终止作用的影响. 结果证明在缺失了boxA及部分上游序列的情况下,大肠杆菌RNA聚合酶不能通读转录终止子. 结论λ噬菌体左向操纵子具有与右向操纵子不同的转录调控现象.
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用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株的构建
目的 利用λ噬菌体Red重组酶系统,构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株.方法 采用PCR方法,将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉索抗性基因拼接,使其两端带有与四环素基因同源的36 nt序列;利用λ噬菌体Red重组酶系统,将其整合到大肠杆菌XL1-Blue的附加体上,以替换掉四环素基因,经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,获得包装菌株XLe-pⅢ;将基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组导入包装菌株,制备缺陷型辅助噬菌体,集落形成试验检测缺陷噬菌体的感染能力.结果 所构建的包装菌株XLe-pⅢ经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,证明氯霉素抗性基因已与噬菌体基凶Ⅲ一同整合到附加体上,重组菌不能在含有氨苄西林的LB培养基中生长,仍保留四环素抗性;该包装菌株能用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,制备的缺陷型辅助噬菌体的滴度为3.0×108.结论 利用λ噬菌体Red重组酶系统,已成功构建崩于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株,以其制备的缺陷型辅助噬菌体有望用于常规筛选或SIP体系.
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噬菌体cDNA展示文库技术及其在寄生虫学中的应用
该文介绍了噬菌体cDNA展示文库技术的原理和发展,以及由多种载体构建的cDNA展示文库的特点,重点阐述早应用于噬菌体展示技术的丝状噬菌体M13以及目前广泛应用的λ噬菌体.作为噬菌体展示文库技术的分支,噬菌体cDNA展示文库技术广泛应用于各种天然配体-受体相互作用的研究,是研究各种寄生虫的结构与功能的基础,在寄生虫病诊断与致病机制研究及疫苗开发与药物研制等方面发挥重要作用.
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新疆分离细菌的提取物对λ噬菌体紫外诱导的抑制作用
本研究从我国夏季高温、强辐射的新疆塔里木地区采集样品,进行了细菌的分离、纯化及分类鉴定.用丙酮萃取法抽提39个分离菌株的培养产物,通过高效液相色谱和紫外-可见吸收光谱分析其主要组分;利用λ噬菌体紫外诱导系统研究抽提物清除自由基的能力.高效液相色谱和紫外-可见吸收光谱分析的结果表明:多数分离菌株丙酮提取物的主要组分为类胡萝卜素物质.λ噬菌体紫外诱导系统抑制实验结果表明:29个菌株的丙酮提取物对λ噬菌体的紫外诱导具有不同程度的抑制作用,抑制率高达81%.不同菌株之间的比较试验显示不同属细菌的丙酮提取物对λ噬菌体紫外诱导系统的抑制效果存在很大差异,其中以Methylobacterium的抑制作用强;不同颜色菌株提取物的抑制效果也出现较大差异;Koanria中不同颜色菌株的抑制效果也有类似结果.本文为类胡萝卜素可能是该类细菌具有抗辐射能力的内因之一提供了直接证据.同时,也证实了λ噬菌体紫外诱导系统是一种很好的探讨细菌抗辐射机理的研究模型.
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两种氨基修饰的基因芯片表面制备方法比较
目的探讨两种氨基化方法修饰玻片表面的过程及其在基因芯片制备中应用的可行性.方法玻片经清洗、硅烷化后,一种用多组分多氨化合物包被,经次亚苯基二异硫氰酸盐表面活化;另一种方法采用的包被剂是丙烯酸-丙烯酰胺单体,活化剂是碳二亚胺/N-羟基琥珀亚胺酯官能团分子.将被修饰好的玻片用于λ噬菌体基因组DNA芯片的制备,并进行杂交检测分析.结果经两种方法修饰后玻片表面分别形成分支结构和聚合物涂层,与商业化的芯片比较发现,两种芯片杂交、扫描检测后显示所得点阵的杂交信号均匀、稳定、清晰,杂交点饱满、同一性好.结论两种方法修饰的玻片用于制备基因芯片均取得了成功,其中丙烯酸-丙烯酰胺聚合物包被法处理过程简单、成本低廉、能大规模生产,是一种较理想的芯片表面制备方法.
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白念珠菌菌丝相全长cDNA文库的构建和鉴定
目的 利用SMART(Switching Mechanism At 5'end of RNA Transcript Method)技术,构建高质量的白念珠菌菌丝相(芽管)全长cDNA文库.方法 不完全1640培养基诱导高于95%的白念珠菌带芽管孢子,提取总RAN并纯化poly A' RNA作为模板,应用SMART技术利用SMARTScribe(TM) MMLV反转录酶和经修饰的oligo(dT)引物(CDSⅢ/3'PCR引物)合成第一链cDNA,SMART Ⅳ(TM)寡核苷酸作为mRNA5'端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,经蛋白酶K消化、Sfi I酶切及过柱分级分离后,与λTriplE×2载体连接经噬菌体包装后转导大肠杆菌,构建全长cDNA文库.结果 原始菌丝相白念珠菌cDNA噬菌体表达文库滴度为1.87×10(7)PFU/mL,重组率达100%,库容量9.35×10(6);文库扩增后,滴度达5×10(9)PFU/mL,插入cDNA长度多在0.4-2.5kb,平均长度在1.5k6左右.文库的代表性和重组片段的序列完整性均达建库要求.结论 成功构建了菌丝相白念珠菌cDNA噬菌体表达文库,为进一步筛选和克隆白念珠菌芽管特异性抗原表达基因及致病性相关基因奠定了基础.
