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同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达
目的 观察仅转染无启动子绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA全长片段能否使整合有GFP基因的胰腺癌细胞内GFP表达降低.方法 用pEGFP-C1质粒转染人胰腺癌细胞株PANC-1,G418筛选及流式细胞术分选建立GFP蛋白高表达的稳定细胞株.用PCR方法从pEGFP-C1扩增出GFP基因全长cDNA并将其克隆至无启动子的复制型质粒PUC19,得到重组质粒即PUC-GFP.实验分为4组:空白对照组、空质粒组(PUC组)、GFP重组质粒干扰组(PUC-GFP组)、GFP小RNA干扰组(siGFP组).分别用稳定表达GFP和未经处理PANC-1细胞进行实验.用Western印迹、流式细胞术与倒置荧光显微镜检测重组质粒对细胞内稳定表达的GFP的影响及对GFP阴性细胞pEGFPC1质粒瞬时转染后绿色荧光表达强度的影响.结果 PUC-GFP可使稳定细胞株内的GFP表达下降,并且呈剂量依赖性.PUC-GFP组绿色荧光强度减弱程度和空白对照及空质粒组差异有统计学意义(P＜0.05)和siGFP组差异无统计学意义(P＞0.05).转染后第4天GFP表达降低并可持续至第6天,第4天后PUC-GFP组和siGFP组对GFP的抑制差异无统计学意义(P＞0.05).PUC-GFP与pEGFP-C1共转染GFP阴性PANC-1细胞株可使pEGPC1的瞬时转染效率降低.这两种情况下,荧光降低程度均和转染PUC-GFP的量呈正相关.结论 仅转染无启动子的某个特定基因的全长cDNA能使哺乳细胞内相应同源性基因的表达降低.DNA干扰可用于哺乳动物细胞.
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人乳头瘤病毒6b型L1基因的克隆及表达
目的 研究尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒(HPV)6b型晚期基因L1(HPV6bL1)在真核细胞内的表达.方法 PCR技术扩增原核重组质粒PQE40-HPV6bL1中L1基因,酶切后与真核表达质粒PEGFP-C1连接,转化人感受态大肠埃希菌DH5α,经扩增后酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序.以重组质粒PEGFP-HPV6bL1转染COS-7细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达,RT-PCR检测HPV6bL1 mRNA的表达.结果 双酶切及测序鉴定显示,重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,PEGFP-HPV6bL1构建成功.重组体成功转染进COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR检测到HPV6bL1 mRNA的表达.结论 建立了HPV6bL1绿色荧光真核表达系统,为研究该蛋白质的功能莫定了基础.
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绿色荧光蛋白基因转染小鼠胚胎干细胞及向神经细胞的分化
目的 建立能够稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠胚胎干细胞(ESC),并诱导其向神经细胞分化,为临床移植治疗神经系统疾病提供方便追踪观察的神经细胞.方法 分别用脂质体、电穿孔转染法转染小鼠胚胎干细胞系R1,检测48 h转染效率;经G418筛选后,得到稳定高效表达GFP的ESC克隆,通过碱性磷酸酶(AKP)染色检测ESC的生物学特性;利用单层分化法诱导转染GFP的胚胎干细胞向神经细胞分化,通过免疫荧光检测神经细胞特异标记Toil.结果 转染48 h的GFP阳性细胞转染率脂质体组为65%,电穿孔组为79%,两组比较差异无统计学意义(X2=3.14,P0.05).转染GFP的胚胎干细胞AKP染色阳性,并可诱导分化为Tuj1阳性的神经细胞.结论 建立稳定表达GFP基因的胚胎干细胞克隆,获得的转染GFP的胚胎干细胞能够分化为神经细胞.
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绿色荧光蛋白转基因大鼠脂肪间充质干细胞的培养及分化潜能鉴定
目的 建立大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外分离培养的方法,并鉴定其分化潜能.方法 取SPF级绿色荧光蛋白(GFP)转基因大鼠腹股沟脂肪,用胶原酶法消化获取原代细胞并进行传代培养.获得的P3代ADSCs,观察其细胞形态及荧光强度衰减情况;用流式细胞仪分析其表面特异性标志物,进行细胞表型鉴定;分别用成脂诱导培养基和成骨诱导培养基诱导其向脂肪细胞与成骨细胞分化,组织化学染色检测细胞分化的情况;将细胞悬液多点注射于大鼠烧伤创面及创周皮下,观察其定植情况.结果 从成体GFP大鼠脂肪组织中成功分离培养出ADSCs,该细胞呈长梭形、漩涡样生长,传代后细胞生长增殖速度加快.ADSCs对CD29、CD90及CD105呈现高表达;对CD34及CD45呈低表达;茜素红和油红O染色显示ADSCs具有成骨成脂多向分化能力;在创面可见散点状绿色荧光.结论 成功获得高纯度、稳定表达的GFP转基因大鼠的ADSCs,且生长增殖能力强,具有多向分化潜能.采用GFP转基因大鼠来源的ADSCs简单易行且示踪效果良好,可用于后续实验研究.
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9型重组腺相关病毒转染大鼠心脏成纤维细胞的体外研究
目的:研究9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心脏成纤维细胞的转染效率及其对细胞生长的影响.方法:分离、获取并培养大鼠心脏成纤维细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-EGFP)转染大鼠心脏成纤维细胞,以转染复数 (MOI)将细胞分为未转染病毒A组、B组MOI=1×104 、C组MOI=1×105 、D组MOI=1×106 ,倒置荧光显微镜下观察大鼠心脏成纤维细胞中EGFP的表达情况,观察转染后细胞生长形态,应用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对大鼠心脏成纤维细胞的转染效率,应用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响.结果:D组的细胞于转染后24h即可观察到EGFP表达,B组与C组细胞则于48h观察到EGFP的表达.倒置荧光显微镜下观察转染后大鼠心脏成纤维细胞生长及形态正常,镜下观察显示各组细胞表达EGFP的强度随MOI值的增高而增强,同时亦随着时间延长而增强,EGFP表达在转染120h达到高峰,此时检测rAAV9-EGFP对心脏成纤维细胞的转染效率,分别为B组:(2.6 ±0.2)%,C组:(7.3 ±1.4)%,D组:(45.1±2.7)%.AlamarBlue法检测表明转染组细胞各时点与未转染组的还原率比值接近于1.结论:rAAV9-EGFP能够有效转染大鼠心脏成纤维细胞,转染后EGFP基因能够有效得以表达,rAAV9对细胞增殖无明显抑制.9型重组腺相关病毒可作为基因治疗心脏疾病研究的理想载体.
